单细胞基因表达分析的新型工具[新品推荐]

细胞个体之间，甚至具有相同遗传背景的体外培养细胞个体之间也是不尽相同的，不同细胞在酶活性、基因表达和细胞信号转导方面有很大的差异。因此，随着对细胞研究的逐渐深入，科学家们开始解析单个细胞的行为。

然而要分析单个细胞，却不是一件容易的事情。目前多种分析技术，都是为细胞群体而设计的，需要一定的样本量。对于激光捕获显微切割的组织、FACS分选的细胞，以及干细胞等稀有细胞，它们的细胞数量有限，直接限制了其下游应用。好在，生命科学迅猛发展，新技术新产品不断涌现，让这个不再是难题。美国Signosis公司就推出了一系列产品，适用于单细胞的基因表达分析。

跳过RNA制备，裂解后直接反转录

基因表达研究，通常是从RNA制备开始的，之后再是cDNA合成和PCR。然而，一般的RNA提取试剂盒都至少需要1×10⁵个细胞，况且，RNA本来就不多，再经过几下折腾，估计就所剩无几了。为此，Signosis公司推出了CLTM细胞裂解缓冲液。样品经CLTM处理后，无需制备RNA，即可直接用于反转录。这样，少量细胞也能得到可靠的结果。

操作过程也相当简单，用PBS洗涤细胞后，对于10⁴-10⁵个细胞，加入100 μl裂解缓冲液，若细胞数量在2000-10000个，则加入20 μl裂解缓冲液。之后在75° C孵育15分钟，这一步裂解细胞，释放RNA，同时让RNase失活。之后，细胞裂解液可立即使用，或放入-80° C冰箱，留待后用。

在获得细胞裂解液之后，可直接进行逆转录，也就是说直接加入4 μl细胞裂解液到逆转录反应体系中，不需要像其它试剂盒一样，加入总RNA哦，千万别忘了。得到的cDNA可进行各种基因表达分析，例如进行PCR或qPCR以及以下NFkB调控基因表达的分析。

此外，也可以配合Signosis的微孔板杂交阵列使用，直接检测细胞裂解液中多个基因的表达。目前Signosis推出了一系列微孔板阵列试剂，适合NFkB调控基因、HIF调控基因和干细胞基因表达的研究。

NFkB调控基因的检测

NFkB 是一种广泛存在的转录因子，在细胞对各种刺激的反应中起着重要作用，这些刺激包括：压力、细胞因子、自由基、紫外线照射、氧化的LDL、细菌和病毒的抗原。NFkB的异常调节与癌症、炎症、自身免疫性疾病、脓毒性休克、病毒感染和不适当的免疫进展相关联。NFkB激活时，与其抑制剂IkB解离，从细胞质移到细胞核，在此与靶DNA 结合，正调节基因的转录，参与免疫和炎症反应、细胞调节以及凋亡。

为研究NFkB调控的基因，Signosis开发了一种独特的微孔板阵列试剂。该试剂无需RNA制备，直接用细胞裂解液通过反转录合成cDNA，然后用合成的cDNA探针进行微孔板阵列的杂交。通过预包被在微孔板上特异的寡核苷酸，靶基因被特异地捕获，并通过HRP检测。在加入HRP发光底物之后，发光程度用微孔板发光检测仪表示为RLUs，而基因表达水平则直接与发光强度成正比。整个流程如ELISA实验一样简单，如下图所示。

试剂盒中提供了一块96孔板，预包被有23个不同的捕获寡核苷酸，可分析Bcl2、p53、myc、TNFα等因子的表达。在一块板上，您可以定量分析最多4个样品的基因表达差异。与传统的PCR相比，这种微孔板阵列可一次获得23个基因的表达数据，更加省时省力。

HIF调控基因的检测

快速生长的肿瘤会出现缺氧区，大部分细胞对缺氧的反应是（1）产生VEGF和其它缺氧诱导的血管生成因子以促进增加血管生成，从而增加组织的氧合（2）从有氧的磷酸化到缺氧的糖酵解的代谢转换。缺氧诱导因子-1（HIF-1）是在缺氧反应过程中有重要作用的一种氧调控转录激动剂。HIF-1a亚单位是氧依赖性泛素化和蛋白酶体降解。细胞因子如IL-1和TNFα刺激HIF-1依赖的基因表达。HIF-1增加促进血流及炎症的数种基因的表达，如血管生成因子（VEGF）。

对于HIF调控的基因，Signosis同样提供了一种微孔板阵列试剂。与NFkB检测产品相同，96孔板上也预包被了23个不同的捕获寡核苷酸，可分析HIF-1、Leptin、VEGF等因子的表达。

干细胞基因表达的检测

干细胞在心脏病、糖尿病、脊髓损伤及多种神经退行性疾病的治疗上有着广阔的临床前景，因此备受关注。如何保证干细胞处于未分化状态或者在需要的时候使细胞向专一的方向分化，是干细胞研究中最大的挑战。为此，Signosis开发出单个干细胞基因表达检测试剂，可同时分析8个干细胞相关基因的表达。

细胞裂解物中的RNA首先反转录成cDNA，随后经T7 RNA聚合酶扩增。扩增的RNA被捕获在96孔板上。检测时，信号被多生物素分子和链霉亲和素结合物进一步放大。微孔板发光检测仪检测发光强度（RLUs），而基因表达水平与发光强度成正比。

除了上面介绍的几个产品，Signosis还推出了一系列cDNA微孔板阵列检测试剂。可检测多个信号通路或关键分子调控的基因。操作简单，灵敏度高，可同时分析两个或以上样品。如需了解更多信息，请点击此处索取更多资料。（生物通 余亮）