一种更为精确的基因组编辑方法[创新技巧]

　　

生物通报道 来自首尔大学的研究人员近日在《Genome Research》上介绍了一种精确的基因组改造方法，只在靶位点实现位点特异的基因组修饰，而不会引入不想要的插入缺失。这种方法使用的是锌指切口酶（nickase），而不是通常所说的锌指核酸酶。

目前，基因治疗领域还存在许多挑战，从导入到预防免疫反应。然而，最基本的挑战在于，如何用新链来取代现有的DNA链，即定向突变。锌指核酸酶是基因组改造的强大工具，但它依赖DNA双链断裂的非同源末端连接修复（NHEJ），此过程容易出错，在靶位点和脱靶（off-target）位点随机产生小的插入或缺失（indel）。

韩国首尔大学的Jin-Soo Kim解释道：“基因组中通常有许多潜在的脱靶位点，因为人类基因天生是重复的。如果您意外在那些脱靶位点引入突变，则可能导致癌症或疾病，因此那些脱靶突变值得关注。”

于是，Kim和他的同事开发出了切口酶，这是一种每次切开单链DNA，引入新遗传物质的酶。由于切口酶只切割单链，而不是像标准核酸酶那样切割双链，故不想要的切口可由细胞内部的单链断裂修复机制快速修复。

研究小组利用Fok1核酸结构域开发出切口酶，但经过修饰，让它只引起单链断裂。他们将其放入人胚肾细胞，来检验切口酶的活性。如果它成功将新的DNA整合到细胞，则细胞会表达萤光素酶基因。

尽管其他研究小组最近也开发出自己的切口酶，但Kim的实验室是第一个研究切口酶对脱靶突变的作用。Kim表示：“我们的数据清晰表明，使用这种方法检测不到脱靶突变。”

他们也发现了切口酶的缺点，即在靶位点上的效率略低于核酸酶。这可能是由于单链DNA断裂引发的同源重组的效率低于双链DNA断裂引发的同源重组。他们认为，用户应仔细评估切口酶和核酸酶在特定应用上的优势和劣势。

由于核酸酶介导的同源重组更加高效，故核酸酶仍然是传统基因knockout和knockin实验的理想工具。对于干细胞研究和基因治疗等比较关心脱靶突变的应用，切口酶带来的精确基因组编辑可能更理想。

研究小组计划下一步研究单链断裂修复中关键基因的作用，以便提高切口酶的效率。Kim认为：“核酸酶已经存在了几十年，并经过优化。切口酶才出现了几个月，因此我们仍需要时间来提高效率。”（生物通 薄荷）

原文检索:

Precision genome engineering with programmable DNA-nicking enzymes

摘要：

Zinc finger nuclease (ZFNs) are powerful tools of genome engineering but are limited by their inevitable reliance on error-prone non-homologous end-joining (NHEJ) repair of DNA double-strand breaks (DSBs), which gives rise to randomly-generated, unwanted small insertions or deletions (indels) at both on-target and off-target sites. Here, we present programmable DNA-nicking enzymes (nickases), which produce single-strand breaks (SSBs) or nicks, instead of DSBs, that are repaired by error-free homologous recombination (HR) rather than mutagenic NHEJ. Unlike their corresponding nucleases, zinc finger nickases allow site-specific genome modifications only at the on-target site, without the induction of unwanted indels. We propose that programmable nickases will be of broad utility in research, medicine, and biotechnology, enabling precision genome engineering in any cell or organism.