实时PCR的可靠性?(上)

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2012年05月10日 来源:生物通

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  两个人完成同样的实时PCR(real-time PCR)实验有可能得到不同的结果。研究人员正在量化这一差异性以了解它的来源以及如何解决这一问题。

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生物通报道  两个人完成同样的实时PCR(real-time PCR)实验有可能得到不同的结果。研究人员正在量化这一差异性以了解它的来源以及如何解决这一问题。

当一个细胞中某个基因的表达增高时,首先衡量的可以是基因与它的最终蛋白质产物的中间分子——信使RNA(mRNA)。对于希望基于健康、环境或内部线索对细胞进行追踪的科学家们而言,测量mRNA分子的改变是一种追踪细胞基因上调、下调、开启或关闭的最好的途径。

自从20世纪90年代中期以来,逆转录定量PCR(RT-qPCR)即成为了追踪单细胞中mRNA分子浓度的常用方法。然而RT-qPCR的每一步都可能将错误引入到实验中。现在,一些科学家们正试图退后一步观察如何能够通过优化将RT-qPCR应用于研究领域,来改善他们的研究数据。

葡萄牙米尼奥大学微生物学家Nuno Cerca 说。“当前有大量的研究工作针对标准化qPCR方法。然而我认为它仍被低估了。尽管遵循标准化指南,我们可以获得重现性好的研究结果,但它们并不可靠。”

Cerca提到的现有指南是指MIQE(Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments), 简称mykee,是一套在国际上最新推出的指导方针,就评价qPCR实验和发表文章时所必需的实验信息提出了最低限度的标准。这些指南首次由伦敦大学玛丽皇后学院的分子生物学家Stephen Bustin领导的研究小组于2009年发布在《临床化学》杂志(journal Clinical Chemistry)上。该指南提出了研究人员应该纳入到他们的qPCR实验中的一些细节以确保获得准确的结果。它们被分为四个关键领域:样本质量控制、实验设计、PCR效率和标准化。

“在同行评审的文献中MIQE指南现已被引用超过600次,成为了《临床化学》发表的论文中引用排名第八的文章。因此这一信息已经开始传播至整个研究群体,”Bustin说。

然而有一些研究人员却并没有审核MIQE推荐的优化步骤继续开展qPCR实验,并公布他们的研究结果。“我认为这些人并不是不知道这一指南,只不过为了所谓的方便不想遵循它们而已,”加拿大国立科学研究所(INRS)Armand-Frappier 研究所的Cathy Vaillancourt说。

回归基础

在加拿大国立科学研究所的实验室中,Vaillancourt研究了健康孕妇与患有妊娠糖尿病或先兆子痫孕妇的胎盘差异。为了了解这些疾病,Vaillancourt和她的同事们观察了在不同胎盘中基因表达水平的差异。她们依赖RT-qPCR来定量指定目的基因生成的mRNA量。

去年,Vaillancourt开始利用新型的Bio-Rad实时PCR仪开展一系列的RT-qPCR 实验。然而当她的两个学生从事相同的实验时,他们得到了不同的实验结果。因此,她开始去了解是什么将差异引入了RT-qPCR实验中以及研究人员如何能解决这一问题。她很快确定参考基因是她的研究团队差异性的主要来源。

由于不同的样本有可能开始有着不同浓度的总RNA,为了控制它研究人员必须依靠参考基因——这些基因被认为在所有细胞中以相同水平表达。如果基于RT-qPCR实验,在某个组织中一个参考基因水平要高两倍,那么就意味着研究人员必须将目的基因的浓度减半以确保真实比较相对值。

下接:实时PCR的可靠性?(下)

(生物通:何嫱)

生物通推荐新闻来源:

How Reliable is Real-Time PCR?

Two people can perform the same real-time PCR experiment and get different results. Researchers are quantifying this variability to understand its source and how to fix it.

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