FFPE样品制备和分析宝典（一）[心得点评]

本文介绍了制备和保存FFPE样品的方法，可尽量减少因固定和包埋过程而引起的DNA、RNA和蛋白质量下降。接下来介绍了流程中的提取和分析步骤，并详细介绍了如何高效地从FFPE样品中回收可分析的生物分子，以及需要作出哪些必要的修改，以便开展逆转录和实时定量PCR等下游应用。FFPE样品制备和分析的宝典，绝对不容错过！

全世界福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）组织切片的存档代表了珍贵且来源广泛的生物医学研究材料。随着越来越多的研究人员转向FFPE样品的分子分析，开发特定的操作步骤，考虑这些样品的独特性质就变得越来越重要。本文为完整的FFPE流程提出了建议。其中介绍了制备和保存FFPE样品的方法，其目的在于尽量减少因固定和包埋过程而引起的DNA、RNA和蛋白质量下降。接下来介绍了流程中的提取和分析步骤，并详细介绍了如何高效地从FFPE样品中回收可分析的生物分子，以及需要作出哪些必要的修改，以便开展逆转录和实时定量PCR等下游应用。

一、制备和存档FFPE样品时的重要考虑因素

从FFPE样品中提取出的核酸和蛋白的质量取决于固定和包埋之前、期间和之后如何处理样品。在这一部分，我们确定了影响生物分子质量的主要因素，并建议采取哪些措施，以尽量减少这些因素的影响。

1 样品类型

每种组织都有其特定的生理功能，并就其结构和组成细胞而言是独特的。取决于组织类型，收获后生物分子降解、诱导或修饰的速度可能各异。因此，组织切除和固定的操作应尽快开展（详见2 样品处理）。从富含纤维或脂肪的FFPE组织中纯化分析物时，不需要特殊的裂解条件：相反，福尔马林交联和石蜡的存在决定了分析物提取的要求（详见后文）。

在处理肿瘤组织时，应当注意健康和恶性细胞并不是均匀分布的。因此，同一个组织样品中一块切片的分析结果可能与另一块切片不同。

2 样品处理

从病人身上获得组织标本的手术涉及麻醉、血管结扎、组织的切除以及固定。从病人麻醉到组织固定这段时间内，组织中的基因表达可能发生变化，且可能发生组织自溶。因此，组织固定前的操作时间应当越短越好，以避免RNA转录本和蛋白表达谱发生明显改变。操作中每一步的时间应记录在案，这是最低要求。

3 福尔马林固定

组织的固定是将标本放在福尔马林溶液中，此溶液的组分可能有所差异（典型的10%福尔马林溶液可能含有3.7% 甲醛以及1-1.5% 甲醇）。产生的化学反应导致生物分子之间的交联，包括核酸之间、蛋白之间，以及核酸和蛋白之间的交联。为了获得最佳的结果，应当使用中性的福尔马林缓冲溶液，以取代无缓冲或酸性的溶液。中性缓冲液减缓福尔马林的降解，而通常认为其降解产物会损害核酸的质量。

而另外3个影响组织固定程度的因素也很重要：组织标本的厚度、福尔马林溶液的体积和固定过程的持续时间。固定不足（underfixation）可导致组织标本中福尔马林未渗入的较深区域的核酸和蛋白降解，或基因表达发生改变。过度固定（overfixation）则导致更密集的交联，让有用核酸和蛋白的提取变得更加困难。

福尔马林大约以1 mm/小时的速率渗透组织。此外，福尔马林的渗透速率随组织厚度的增加而降低。因此，在固定一个组织标本时，它应当足够薄，以避免周边的过度固定和中间的固定不足。在一个比较不同大小样品固定过程的实验中，QIAGEN的研究人员发现，在固定整个组织（厚度大约1 cm），而不是组织切片（厚度约4 mm或以下）时，RNA显著降解（图1）。为了获得最佳的结果，通常建议固定最多5 mm厚的组织标本。

福尔马林与组织的比例至少应为10:1，以确保最佳的固定。在处理小的组织标本，如穿刺活检时，这很容易实现。然而，在处理大的组织样品时，固定所用的福尔马林可能不足。在这种情况下，组织切片应当切割后再进行福尔马林固定。

组织的固定不应超过24小时，以避免过度固定。在一个比较过夜固定和72小时固定的实验中，QIAGEN的科学家观察到，固定时间对RNA完整性几乎无影响（图2）。然而，他们也发现，72小时固定对纯化后RNA在一步法RT-PCR中的表现有不利影响：较大的扩增子无法成功扩增，这极有可能是因为RNA分子的过度交联和较高比例的不可逆交联（图1）。另一个实验表明，72小时的固定降低了FFPE样品中蛋白的回收率（图3）。这种不利影响同样是由于交联增加。

图1. 样品厚度对RNA完整性的影响。大鼠组织以整个器官或≤4 mm的切片进行福尔马林固定和石蜡包埋。A 包埋后3天利用RNeasy® FFPE Kit 纯化RNA，并利用Agilent® 2100 Bioanalyzer分析。在整个大脑的电泳峰图中，双箭头指出了18S rRNA和28S rRNA的峰减少，表明RNA片段化的增加。B 纯化的RNA被用于一步法RT-PCR中，利用大鼠Rpl4基因特异的不同引物对和QIAGEN OneStep RT-PCR Kit。从左到右，扩增子大小分别为96、206、400、613和785个核苷酸。整个器官的分析中较大扩增子的缺失表明较大的RNA存在降解。（数据引用自von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）

图2. 固定时间对RNA完整性和一步法RT-PCR的影响。各种大鼠组织经过福尔马林固定（过夜或3天）和石蜡包埋。为了比较，大鼠组织以RNAlater® RNA Stabilization Reagent稳定。包埋后3天利用RNeasy® FFPE Kit纯化RNA，并利用Agilent® 2100 Bioanalyzer分析。此外，利用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit和大鼠Rpl4基因特异的引物对开展一步法RT-PCR。扩增子大小如图所示，RT-PCR的结果以颜色显示：红色表示无扩增；黄色表示弱的扩增；绿色表示成功的扩增。尽管较长时间的固定对RNA片段化和核糖体条带影响甚微，但较长扩增子的扩增效率差。（数据引用自von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）

图3. 固定时间对蛋白提取的影响。利用10%中性的福尔马林缓冲溶液按照图中所示的时间固定大鼠组织，然后用石蜡包埋。利用Qproteome® FFPE Tissue Kit提取总蛋白。开展A SDS-PAGE分析和B Western blot分析（利用β-actin的抗体）。两种分析表明，固定时间长于24小时会降低所提取蛋白的量。

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4 石蜡包埋

在福尔马林固定之后，组织标本包埋在石蜡中，此过程包含几步。第一步是脱水，其中水被替换成醇类，通常为乙醇。接着是透明，其中醇类被替换成二甲苯或二甲苯替代物，之后是浸蜡，其中二甲苯被置换成石蜡。最后一步是包埋，整个标本被石蜡包围。在浸蜡之前，组织标本必须完全脱水，因为残留的水分可能导致样品降解。石蜡包埋是维持蛋白完整性的关键一步，因为残留的水分可能导致蛋白水解。因此，应当使用未经水稀释的高质量试剂，且整个包埋过程的持续时间和温度应当优化，以实现彻底的脱水。我们建议使用新鲜的醇类和二甲苯，以避免过去使用时水分残留的可能。

浸蜡和包埋福尔马林固定组织中使用的石蜡的熔解温度和组分可能各异。在使用熔解温度高的石蜡时，包埋过程需要较高的温度，这可能导致样品降解增加。为了确保从FFPE样品中可用核酸和蛋白的理想回收，应当使用熔解温度低的石蜡。此外，应当避免包含添加剂如蜂蜡的石蜡，因为它们可能干扰生物分子的回收。

5 染色

为了避免FFPE样品分子分析的问题，样品染色应尽可能避免。某些染料和试剂可能对核酸造成不利影响，特别是那些用于免疫组化染色的试剂。涉及高pH和重金属离子的染色步骤应当避免。如果样品染色是必需的，则首选甲酚紫（cresyl violet），因为它与核酸分析兼容。

从那些利用组织学染料（如苏木精或固红）进行染色的切片中纯化蛋白，可能导致蛋白产量的显著下降。然而，纯化后的蛋白可用于western blotting或反相蛋白芯片分析等下游应用。

6 样品保存

在固定和包埋之后，FFPE样品最好应在最佳温度下保存，这样可减缓核酸和蛋白的降解。在一个比较不同保存温度的实验中，QIAGEN的科学家发现，如果FFPE样品保存在4°C，而不是室温或更高，则RNA在1年后仍基本完整（图4）。

由于FFPE样品中的RNA常常严重片段化，所以对小分子RNA如microRNA（miRNA）而言，回收基本完整RNA的机会高于较长的RNA如mRNA。这意味着检测短扩增片段的分析（如特定miRNA的分析）受福尔马林固定的影响比检测长扩增子的分析（如特定mRNA转录本的分析）要小（图5）。

图4. 保存温度对RNA完整性的影响。各种大鼠组织经福尔马林固定和石蜡包埋。在包埋后3天（T0）或在4°C、20-25°C或37°C保存一年后利用RNeasy FFPE Kit纯化RNA。在Agilent 2100 Bioanalyzer上分析RNA完整性。对于保存在4°C的样品，18S rRNA和28S rRNA对应的峰清晰可见，表明存在完整RNA，而保存在较高温度下的样品却并非如此。（数据引用自von Ahlfen et al. [2007] Determinants of RNA quality from FFPE samples. PloS ONE 12, e1261.）

图5. 保存条件对实时定量RT-PCR表现的影响取决于RNA大小。各种大鼠组织经福尔马林固定和石蜡包埋。利用miRNeasy FFPE Kit纯化得到包含小分子和大分子RNA的总RNA。在包埋后3天（T=0）、室温下保存6个月和37°C保存6个月的RNA样品作为模板，利用miScript PCR System开展实时定量RT-PCR。在ABI 7900循环仪上开展反应。A microRNA miR-29（模板长度：22 nt）和B Hprt1转录本（扩增子长度：94 bp）被检测到。6个月的保存对mRNA分析表现的影响大于对miRNA分析的影响，表明RNA片段化对较长模板检测的影响比极短模板检测要大。

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原文《Critical factors for molecular analysis of FFPE samples》由QIAGEN提供，生物通负责编译。

（未完，待续）