全基因组芯片扫描技术解析自闭症成因[创新技巧]

生物通报道：自闭症又称孤独症，是一种毁灭性的神经系统失调导致的发育障碍，这种疾病被认为是目前世界范围内影响儿童最严重的公共健康问题之一。

对于此类智力落后相关的复杂性疾病成因，常常需要进行多方面多因素分析，基因组拷贝数变异（copy number variations, CNVs）就是其中的致病原因之一。基因组拷贝数变异CNVs是指染色体某段区域发生的重复（duplication）或者缺失，它与点突变(point mutation)的区别是前者是基因组某一段区域发生重复或缺失，而后者是基因组某一个位点发生变异。

目前研究发现某些疾病与点突变有关，如很多单基因疾病；而有些疾病与基因组拷贝数的变化有关，比如一些三体综合症、1q21微缺失综合征以及Miller-Dieker综合征等；更多情况下很多复杂性疾病由点突变和拷贝数变异共同组成其致病原因，如孤独症，先天性心脏病等。

染色体基因芯片分析（Chromosomal Microarray Analysis，CMA）能在全基因组范围内同时检测很多种因染色体拷贝数变异而导致的疾病，因为其通量大，分辨率高，技术平台日益成熟，目前染色体基因芯片已经逐步应用于多种疾病的临床诊断和研究。

来自上海儿童医学中心等处的研究人员收集了多例临床表现为多发畸形/不明原因智力落后患者临床表型的样品，进行高分辨全基因组芯片 (Affymetrix CytoScan^HD)检测，尝试揭示这类疾病的致病原因，对疾病进行基因诊断，并详细描述了基因芯片原始数据分析过程，用以规范芯片数据分析流程。

首先研究人员收集了多发畸形（是指至少两个系统受累，常规染色体核型分析排除常见的三体综合症），以及不明原因智力落后（患者体检和智力测定显示明显落后于同年龄同性别正常小孩）的患者样品，通过外周血常规染色体核型分析，排除常规染色体核型异常样品，然后抽取基因组DNA，利用Affymetrix CytoScan^HD进行染色体基因组芯片分析，芯片产生的Cel原始数据用CHAS软件转换成CYCHP文件，最后根据一系列工作流程解释于临床。对于新发区域拷贝数变异，检测患者父母的样本以判定该变异是新生（de novo）变异还是遗传变异。

Affymetrix Genechip Scaner产生的原始数据Cel文件，经过Affymetrix自带软件AGCC(Affymetrix GeneChip Convert Console)将Cel文件转换成Cychp文件，Cychp文件用Affymetrix自带软件CHAS(Chromosome Analysis Suite)分析。通过和各种数据库结合，每个患者CNV的性质根据一系列完整的流程最终分成四类：临床致病性CNV（Variation of clinic significance, VCS）、临床可能致病性（Variation of possible significance, VPS）、不能解释(Variation of unknown,VUS)以及良性CNV（Benign CNV）。

研究人员在31.5%的患者样品中检测出了染色体的异常，其中发生异常改变最多的是7号和17号染色体。这项研究表明基因组拷贝数变异是多发畸形和/或不明原因智力落后患者的主要致病原因之一，利用CytoScan^HD芯片检测患有此类疾病患者的基因变异，阳性率显著高于常规染色体核型分析。

（Affymetrix基因芯片数据分析流程图）

以往经典地针对多发畸形和智力落后患者的检测手段主要是细胞遗传学的方式。细胞遗传学主要研究染色体畸变与遗传病的关系，对于遗传咨询和产前诊断具有重要意义。目前主要的研究方法有: 1.染色体核型分析；2. FISH(fluorescence in situ hybridization)技术；3.基因组芯片杂交。

其中基因组芯片杂交技术是FISH技术的一大延伸与重大飞跃，它通过单一的一次杂交，可对某一样本整个基因组的染色体拷贝数量的变化进行检查。

根据其原理有两种类型芯片：一种是比较基因组芯片(comparative genomic in situ,CGH)，其基本原理是用不同的荧光染料通过缺口平移法分别标记患者样本和正常样本的DNA制成探针，并与正常样本染色体进行共杂交，以在染色体上显示的患者与正常对照的荧光强度的不同来反映整个患者基因组DNA表达状况的变化，再借助于图像分析技术可对染色体拷贝数量的变化进行定量研究,此类技术以Agilent和Nimblegen为代表；另外一种是基因分型阵列芯片(Genotyping array)，其根本原理是不需要正常对照，它是根据自身相互间SNP位点对比，最后和Hapmap数据库正常人对比。此类技术以Affymetrix和Illumina为代表。

基因芯片作为细胞遗传学检测手段中最新的一种，有相对以往经典的遗传学检测无法比拟的优势：①能在全基因组范围内同时检测很多种因染色体失衡而导致的疾病；②能同时检测到染色体的缺失（deletion）和增加（duplication），并能准确地测定其大小；③能检测到≥10%水平的嵌合体；④分辨率高，相比传统核型分析高出近千倍。染色体基因芯片分析检测平台及技术日益成熟，已经逐步应用于多种疾病的临床诊断和研究，为分子诊断平台的完善提供了重要的技术支持。

2010年，美国医学遗传协会公布指南，将基因芯片首选作为不明原因智力落后，多发畸形不是明确的综合征，孤独症，发育迟缓的一线首选检测技术，而不再是传统的G显带染色体分辨技术。从这项研究来看，CytoScan^HD芯片检测的阳性率也比常规染色体核型分析的阳性率高一个数量等级，Fisher's检验有明显的统计学意义（p=0.001）。

不过研究人员也指出，传统核型分析也有它的优势，基因芯片不能检测平衡易位，也不能检测倒置，也不能检测点突变，同时还会检测出很多意义不明的拷贝数变异。而传统的核型分析可以检测平衡易位和倒置。所以也不能完全摒弃传统的染色体常规检测。

总而言之，将CMA技术应用于临床诊断为先天性多发畸形和智力落后的患者，将会大大提高分子遗传学方法对这些疾病患者的诊断效率，为患者的病因解释、个体化诊疗和遗传咨询等方面给予极大的帮助。

（生物通）