PacBio碱基修饰分析标识微生物、病原菌的表观遗传学标志

Pacific Biosciences的用户现在可以使用公司最新发布的碱基修饰分析方法在微生物和致病菌中（如大肠杆菌Escherichia coli和沙门氏菌Salmonella）研究甲基化及其它表观遗传学事件。

PacBio系统的独特之处在于，不需要进行甲基化测序或重亚硫酸盐测序等额外实验步骤，就能够直接进行表观遗传学分析。PacBio仪器能通过聚合酶动力学分析直接检测碱基修饰。如果序列中存在碱基修饰（如甲基化和羟甲基化），PacBio系统的聚合酶在加入核苷酸时就会出现可检出的停顿，而这种动力学信号就能揭示碱基修饰的存在。

日前，PacBio公司发布了新软件，能在测序数据中标出碱基修饰事件。PacBio RS测序系统和C2化学试剂的用户能免费下载这一软件。用户也可以选择使用自己的生物信息学软件来处理测序数据，对上述聚合酶停顿事件进行分析。

虽然PacBio这一软件的算法目前还不能区分不同类型的碱基修饰，但是日后将会在该软件中整合不同碱基修饰的相关信息，以区分鉴定各种修饰类型。

在PacBio的系统中，每种碱基修饰事件都会使聚合酶的“停顿模式” 产生微小差异，对其进一步分析就能确定修饰的类型。目前，PacBio为细菌甲基化组研究提供了一个检测工具，研究人员能通过基因组甲基化模式来确定甲基转移酶的特异性，从而分析细菌的甲基化组。并且还为不同的碱基修饰推荐了典型的次级峰值，来帮助研究者精确识别碱基修饰。比如如何使用该软件在细菌基因组中分析6-甲基腺嘌呤和4-甲基胞嘧啶。

此外，PacBio的长读序的优势也将推动表观遗产学的发展,这项技术能帮助研究者更好地理解染色体失活和印迹等表观遗传学事件，还能帮助研究者获得更广泛的表观遗传学图谱从而更好地分析发育和疾病进程。

美国能源部联合基因组研究所（JGI）和美国农业部（USDA）等PacBio用户正在使用这一软件对重要的生物能源或生物降解微生物，以及食源性疾病或感染牲畜的致病菌进行碱基修饰检测。

众多文献也证明甲基化在微生物生长的基本功能中扮演着重要角色，也有证据显示甲基化也能影响微生物的致病力，例如能引发直接影响致病菌感染能力的疾病变化，而且甲基化类型可能与病菌在人体内的适应性和毒力有关。

有研究小组利用PacBio系统对引发2007年比利时的冰淇淋大肠杆菌疫情和2010年美国亚利桑那州的生菜大肠杆菌疫情的大肠杆菌O145分离株的6个E. coli基因组进行了测序。研究小组利用PacBio的长读序进行基因组装配时将一个分离株中将Illumina 和454联合测序生成的contigs重叠群数量从353个减少到了8个。且该研究团队通过检测基因组的碱基修饰，在引发美国亚利桑那州疫情的菌株中发现了独特的甲基转移酶。而PacBio测序团队也曾在去年夏季德国大肠杆菌疫情菌株中发现相同的甲基转移酶。

引发去年夏季德国疫情的O104:H4菌株是一种肠聚集性大肠杆菌，通过整合噬菌体基因组获得了产志贺氏毒素的能力。PacBio团队在大肠杆菌整合的噬菌体基因组中发现了这种甲基转移酶，另一个团队在美国亚利桑那州疫情分离株中发现了同样的甲基转移酶。这种产志贺氏毒素的噬菌体对于德国疫情中的大肠杆菌O104的致病能力很重要，研究人员认为这种甲基转移酶可能也对菌株的致病力有影响。目前已有不少证据表明甲基转移酶能影响致病菌的致病力。该研究团队表示其下一步研究是对来自加利福尼亚萨利纳斯山谷农业区的6000种产志贺氏毒素的大肠杆菌分离株进行PCR筛选，看它们是否也含有同样的甲基转移酶，会继续应用PacBio平台检测不同疫情菌株的碱基修饰。

目前拥有两台PacBio 仪器的美国能源部DOE联合基因组研究所JGI也正在使用新推出的软件进行碱基修饰分析。研究人员表示，除了常见的5-甲基胞嘧啶，PacBio系统还对检测其它碱基修饰特别有用。如在细菌中很常见的N6-甲基腺嘌呤修饰，很难通过重亚硫酸盐测序等化学转化方法检测到，该研究所正在使用PacBio对其测序的绝大多数细菌基因组进行N6-甲基腺嘌呤检测。

美国NEB公司也在和PacBio合作对限制性内切酶的N6-甲基腺嘌呤和4-甲基胞嘧啶以及相关DNA甲基转移酶进行检测。他们利用PacBio进行测序和剪辑分析，先在只有两到三个限制性修饰系统的细菌基因组中检验实验方案的可行性，通过对全基因组测序和甲基化位点检测，研究人员可以找到甲基化酶的识别位点。

NEB公司正在研究一类特殊的限制性内切酶，传统的方法难以确定它们的识别序列，这是因为这些酶随机进行剪切，所以确定其识别位点的唯一方法是直接检测甲基化位点，但通常要进行几个月的实验才能得到一个清晰的识别位点。NEB公司采用了PacBio的系统来完成这项工作，尽管5-甲基胞嘧啶引发的PacBio信号并不像N6-甲基腺嘌呤或4-甲基胞嘧啶那么强，但他们仍开发出了有效的检测方案。到目前为止的甲基化研究都是与PacBio合作完成的，良好的实验结果让NEB公司决定准备购买一台PacBio单分子测序仪器。

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