专访董梦秋：学科交融，思想交融的结晶

　　

生物通报道：古人云，道生一，一生二，二生三，三生万物，世间万物形态各异，由此衍生出了各种思维和各种学科，将不同的思维，不同的学科交融在一起，往复生一，往往又能获得令人欣喜的新发现，譬如DNA双螺旋结构的发现，譬如染色体在遗传中的作用的发现。

近期北京生命科学研究所董梦秋实验室，就与中科院计算技术研究所贺思敏教授研究组合作，通过学科交融，思想交融，获得了一项重要的研究成果——一套完整的基于高精度质谱鉴定化学交联肽段的新技术方法，这一技术正是由这两大研究组结合了质谱技术，生物信息学等多学科方向获得的，正如董梦秋研究员所说的那样：“这是集体智慧的结晶”。

这一研究成果公布在Nature Methods杂志上，Nature Methods是方法学领域的国际权威刊物，主要刊载具有创新性的技术进展，目前为止国内在此刊物上发表的技术文章仅有3篇。为了更深入了解最新这项技术成果的方方面面，生物通特联系了董梦秋研究员，就读者感兴趣的问题请教了她。

（董梦秋博士，图片来源：NIBS）

 

CXMS是什么？

蛋白质化学交联结合质谱鉴定技术（chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry analysis，CXMS）是一种能够提供丰富的蛋白质折叠与蛋白质相互作用的信息的新技术。这种技术能够帮助测定蛋白质的结构以及蛋白质复合物亚基之间相互作用的界面。

这种技术的优势在于不需要蛋白质晶体，也不需要大量的高度纯化的蛋白，除了对蛋白样品的量与纯度要求较低，CXMS技术的实验周期也短，因而具备广泛的适用性。

应用CXMS技术需要注意的是，在进行实验的时候，需要的起始蛋白量，比常规的蛋白质鉴定要高。一级、二级质谱皆为高精度，其它没有特殊要求，目前很多常用的高精度生物质谱仪都可以用于CXMS数据采集。

虽然目前CXMS技术还只能提供鉴定到的交联氨基酸之间的空间距离信息，但是它可以补充现有的结构生物学技术，而且还有望与蛋白质免疫共沉淀或pull-down 结合，辨识直接相互作用的蛋白。

在最新研究中，董博士等人优化了CXMS的各个实验环节，由此提出了一套完整的基于高精度质谱鉴定化学交联肽段的方法，董博士说，“优化的环节包括样品制备、色谱方法、质谱方法和数据分析。凡是我们能想到的都比较测试过了。例如，质谱检测方面，我们系统地比较了CID、HCD、ETD三种不同的肽段碎裂模式。最后，集中优化HCD的实验条件，如排除1价电荷、2价电荷母离子，提高HCD的碎裂能量，以及调整其它的相关质谱参数。”

另外一个方面，普及CXMS技术的关键还在于一个高度有效的数据分析方法，因此董博士等人开发了一种化学交联多肽的鉴定软件：pLink。

pLink是什么？

pLink软件是这篇论文的关键点之一，这一软件是在pFind基础上开发出来的，后者是中国第一个具有自主知识产权的网络版蛋白质鉴定软件pFind (http://pfind.ict.ac.cn)。

据董博士介绍，pFind研发始于2003年，是针对普通（非交联）肽段的质谱数据的搜索引擎。经过近十年的发展，pFind在各项指标上均已达到或超过国际同类软件，多年来在ABRF-iPRG国际评测中获得好成绩。pLink基于pFind，定向解决交联肽段的质谱数据分析问题，在继承pFind框架和技术的同时需要解决自己独特的问题，是pFind的非平凡扩展与延伸。

“pLink针对交联肽段的质谱数据（CXMS）进行了一系列的设计与优化，预处理、打分、评价、标图等环节均有自己的独到之处，是鉴定交联肽段的利器。这一软件可以从两条交联肽段的二级质谱图中同时鉴定两条多肽的序列及交联位点，适合多种普通的交联剂，如氨基－氨基、氨基－巯基、氨基－羧基交联；不要求交联剂有轻、重同位素标记。

为了训练pLink软件，我们采集了700多套合成肽段的交联质谱数据，前后做了上千次实验，为了保证质量，都是手工上样完成的。优化后的CXMS技术适用的样品范围更广，不依赖于特殊的交联剂，具有极高的通用性。普通的生物实验室，只要能找到高精度质谱仪分析交联样品，就可方便享用CXMS技术。”

pLink的优势与不足

pLink解决了交联质谱数据分析中的两大难题，即复杂样品的大数据库问题（不至于一套数据要计算机搜索一年）和交联鉴定的质控问题（如何准确估计和控制鉴定结果的假阳性率）。“这两个问题解决了，CXMS就可以为很多生物领域的研究人员服务了”，董博士指出，“这也是打动Nature Methods杂志编委的原因之一。”

不过这种方法也存在不足，董博士说，“这种方法的不足之处在于只能提供鉴定到的交联位点之间的空间距离信息，如果所关心的区域没有一对在化学和空间上可以交联的氨基酸，或者产生的交联肽段的色谱或质谱性质不佳，CXMS就鞭长莫及。另外，这一方法的灵敏度还有待提高，比如对于体内免疫共沉淀的样品。”

目前pLink公开使用，对于学术研究机构提供免费下载（http://pfind.ict.ac.cn）。

技术交融

董博士实验室主要研究方向有两个，一个是质谱技术，一个生物学，董博士将这两种技术结合起来，使其相辅相成，“生物学不断为质谱技术提出新的需求和目标，近20年来质谱技术日新月异，生物学功不可没。反过来，质谱技术帮助解决生物学问题，极大地推动了生命科学的发展。两者相辅相成。”

通过这样的技术交融，董博士实验室取得了不少重要的成果，比如今年年初，其研究组还发表了另外一篇文章，用不依赖于蛋白数据库的肽段从头测序的新技术为生物学家解决了实际问题。

肽段从头测序，即de novo peptide sequencing，是指不依赖蛋白质数据库，直接从串联质谱图中提取肽段完整序列或者序列片段的方法。这种方法的主要思想是，通过对谱图中谱峰所属的离子类型的分析，以及谱峰与谱峰中间的质量差与一个或多个氨基酸质量的关系，直接在谱图中推断出完整或者接近完整的序列。这种方法不依赖于任何数据库信息，对研究氨基酸突变、新物种的蛋白质测序问题等有一定优势。但是，这种方法对谱图质量的依赖性较高。

自动化的从头测序方法在上个世纪90年代发展起来，但由于其面对的往往都是低精度的碰撞诱导解离（CID)谱图，因此谱图解析率并不高。对同等情况下的数据库搜索结果，从头测序往往只能够解析其中30%左右的谱图。因此，从头测序并没有在解决生物学实际问题中得到应用。

董博士解释道，“针对上述情况，我们基于高精度的高能碰撞诱导解离谱图（HCD），在2010年设计并实现了从头测序算法pNovo。

HCD谱图具有三大特点：1. 二级谱峰精度高，一般误差半径在20ppm左右；2. 检测到的离子系列较CID谱图更全，使得推断完整序列信息可能性更大；3. 内部离子及亚胺离子信息丰富，进一步提供了相似序列之间的区分依据，这一点是CID谱图几乎完全不能够提供的。

因此，我们在设计pNovo算法的同时，也充分考虑了上述特点，并用不同复杂程度的样品检验它的有效性。无论是简单的蛋白质混合物还是复杂的细胞裂解液样品，pNovo均能成功解析数据库搜索结果的80%以上的谱图。我们也在近期扩展了这一算法，即将推出pNovo+，利用HCD与ETD谱图对的互补信息辅助进行从头测序，使得从头测序的精度有了进一步的提高，速度也将至少提高一个数量级。”

欲了解董梦秋研究组更多信息，请参阅：http://www.nibs.ac.cn/index.php?act=view&id=1219

（生物通：王蕾）  

原文摘要：
Identification of cross-linked peptides from complex samples
We have developed pLink, software for data analysis of cross-linked proteins coupled with mass-spectrometry analysis. pLink reliably estimates false discovery rate in cross-link identification and is compatible with multiple homo- or hetero-bifunctional cross-linkers. We validated the program with proteins of known structures, and we further tested it on protein complexes, crude immunoprecipitates and whole-cell lysates. We show that it is a robust tool for protein-structure and protein-protein–interaction studies.

作者简介：董梦秋博士

北京生命科学研究所研究员

研究概述：

本实验室的研究主题包含生物学和质谱技术两部分，二者相辅相成，共同发展。

在生物学研究方面，我们以线虫为模式生物，试图了解衰老过程及其调控机制。在自然衰老过程中，线虫的转录组和蛋白质组将不可避免地发生一系列变化，借助高通量测序及质谱技术，我们可以对这些变化进行定量分析，并进一步探讨这些变化在长寿突变体线虫与野生型线虫之间有何不同。衰老过程在细胞器水平（如线粒体）上引起的变化也在我们的关注范围之内。对这些变化进行分析与归纳可以使我们更加深入地认识衰老过程，并为进一步研究调节衰老的机制打下坚实的基础。在衰老的调节机制的研究中，我们主要关注胰岛素信号通路。目前已经知道，从最上游的胰岛素受体直至下游的FoxO转录因子，所有胰岛素信号通路的关键组分都具有调节寿命的功能。然而，FoxO转录因子可以在转录水平调节一系列靶蛋白，哪些关键靶蛋白最终导致了寿命的延长仍不甚清楚。我们致力于找到这些关键靶蛋白并研究它们之间的关系，籍此了解胰岛素信号通路调节寿命的奥秘。同时，我们也在积极研究DAF-16（FoxO在线虫中的同源蛋白）的翻译后修饰状况。DAF-16是调节衰老的一个关键转录因子，其活性受到一系列蛋白激酶和磷酸酶（如钙调磷酸酶）的严密调控。我们试图探究来自外部环境和线虫体内的各种讯号如何影响DAF-16的翻译后修饰状况，并进一步阐明不同位点的翻译后修饰的组合如何最终调控DAF-16的转录活性。

在质谱方面，我们致力于基于质谱的蛋白质组学技术的应用与开发，以期为生物学研究提供新的思路与方法。 目前，我们实验室日常的质谱分析工作包括蛋白鉴定、定量蛋白质组学分析以及翻译后修饰分析。样品多是免疫沉淀的蛋白复合物或全细胞裂解液。此外，我们与所内其它实验室以及中科院计算所pFind研究小组合作开发质谱技术，主要包括肽序列从头测序的算法开发、基于电子转移解离（ETD）谱图的高效蛋白质鉴定技术、和通过鉴定交联肽段来研究蛋白－蛋白相互作用的方法。实验室目前共拥有三台质谱仪，包括一台装备了ETD的LTQ-Orbitrap质谱仪，一台离子阱质谱仪HCTultraPTM，以及一台三重四极杆质谱仪TSQ Discovery。