双向电泳的新进展和新工具[新品推荐]

【字体: 时间:2012年08月15日 来源:生物通

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  作为一种很经典的技术,双向电泳仍在不断发展。尽管人们想用新技术来取代它,但是若希望对蛋白质组有全面的认识,其他技术在分辨率和灵敏度上仍然与双向电泳有差距。近几年,从样品制备到数据分析,也有不少新的产品面市。

随着蛋白质组学概念的提出,双向电泳(2D gel electrophoresis)一度曾变得很流行。近几年,因质谱技术的快速发展,LC-MS的热度似乎更高。然而,在某些应用上,双向电泳更有优势。

双向电泳提供了整个样品的鸟瞰图,而这是质谱无法比拟的。它可以对样品中复杂的蛋白质进行整体性的分离,是目前唯一可以在一块凝胶上同时分离成千上万个蛋白质的方法,且分离得到的蛋白质组分的纯度可以达到90%以上。通过它,您可以研究和比较蛋白质组在某些条件下如何变化。

此外,双向电泳分离完整的蛋白,而大部分质谱方法都是研究肽段。因此,开展质谱分析的研究人员很难确定翻译后修饰事件,如两个不同的翻译后修饰是同时存在,还是互相排斥。当然,这两种技术在费用和设备要求上也不能同日而语。双向电泳的设备与质谱仪相比,简直是小巫见大巫。而且,质谱仪还需要专门的人员来操作,没有一定的经验可不敢贸然出手。

当然,双向电泳的重复性也是个无法回避的问题。不过,随着技术的不断发展,研究人员也能够克服这一挑战,发表漂亮的结果。

唐氏综合征研究

英国普利茅斯大学的资深研究员Tracey Madgett曾利用双向凝胶电泳来鉴定唐氏综合征(Down Syndrome)的生物标志物1。据Madgett介绍,采用电泳方法的决定是基于科学和实际的考虑。首先,其他人已采用双向电泳来研究唐氏综合征。更重要的是,她们有双向电泳的设备,但缺乏LC-MS的经验。

Madgett及其同事的研究对象是怀孕头三个月或4-6个月的孕妇,她们怀有一个正常的胎儿或患有唐氏综合征的胎儿。研究人员从她们身上抽取血浆,经处理后开展双向凝胶电泳。

每个样品经过处理后独自跑胶、染色和分析。然而,凝胶之间的差异无法避免。这样就很难通过比较凝胶上的斑点强度来区分差异表达的蛋白。两块胶上的同一位置,也许根本就是两个不同的蛋白,这怎么比较?

为了克服这一问题,GE Healthcare在大约十年前开发出一种多重分析技术,称为荧光差异凝胶电泳(2D DIGE)。2D DIGE的基本实验线路是电泳前以Cy2、Cy3 和Cy5三种荧光染料分别标记蛋白质样品(其中包括一个蛋白质内标)。然后将标记好的蛋白质样品混合,在同一块胶上进行双向电泳。电泳结果分别用3种不同的激发波长得到不同颜色的荧光信号,根据这些信号的比例来判定样品之间蛋白质的差异。

2D DIGE技术第一次在双向电泳中引入了内标。DIGE的内标是将试验中所有样品取等量混合,单独用一种荧光染料(在最小标记染料中通常是Cy2)标记,和所有样品一起电泳。这意味着所有样品中的蛋白质点都会有对应的内标。由于所有样品在电泳过程中经过相同的处理,那么研究人员可准确地鉴别不同条件下的蛋白丰度差异;他们只需收集三幅荧光图像,利用数据分析软件比较即可。

Madgett和她的研究小组就利用2D DIGE来开展唐氏综合征的生物标志物分析。研究人员首先利用QIAGEN的Qproteome Albumin/IgG Depletion Kit去除了白蛋白和IgG这两种高丰度蛋白。之后她们在3块24 cm的2D凝胶上跑胶,这三块凝胶的差别在于第一向等电聚焦时的pH不同。第一块覆盖pH 4.5-5.5,第二块覆盖pH 5.3-6.5,第三块覆盖pH 6-9。研究人员认为,窄范围比宽范围的IPG胶条(如pH 3-10)的分辨率更高。

Madgett表示,通过此次分析,她们在4-6个月的血浆中找到了7个“有希望的线索”。她们将这些斑点切下来,并进行各种质谱分析,来鉴定这些蛋白。Madgett认为她们还需要在更大的队列人群中验证这些线索。谈到2D DIGE,她表示:“这很复杂,但最后获得了结果,我很激动。我还会做的。”

欢迎索取2D DIGE技术的更多资料!

新工具

作为一种很经典的技术,双向电泳仍在不断发展。尽管人们想用新技术来取代它,但是若希望对蛋白质组有全面的认识,其他技术在分辨率和灵敏度上仍然与双向电泳有差距。近几年,从样品制备到数据分析,也有不少新的产品面市。


样品制备

对于双向电泳而言,样品制备是个关键。等电聚焦对污染物(如核酸和脂类)格外敏感,因此如果您想得到一张漂亮的电泳图,那么必须先去除污染物。多家公司都提供这种样品纯化试剂盒。GE Healthcare的 2-D Clean-Up Kit能高效去除污染物,如盐、脂类和核酸。而上文提到的QIAGEN试剂盒也能去除高丰度蛋白。

有时,仅仅去除高丰度蛋白还不能解决问题,这时,您可能需要进一步降低样品复杂度。如果您关注蛋白质组中的特定部分,那么您可以分步分离复杂蛋白,例如分离细胞核、细胞质和膜蛋白,或者分离磷酸化蛋白或糖基化蛋白。默克密理博就提供这种分步分离的试剂盒。

另外,Life Technologies也提供一种ZOOM® IEF Fractionator,能将蛋白迅速浓缩至5个等电点范围内。它的原理和操作都很简单,即在ZOOM® IEF Fractionator样品槽(chamber)之间放置一个个Disk,就可以在一个特异的pH值范围进行分离。例如,如果您想要分离pH值范围在pH4.6到pH5.4之间的蛋白,只需连接一个用pH4.6和pH5.4 Disk分隔的样品槽即可。这种液相的等电聚焦装置便于样品的回收,而且Disk是一次性的,减少了交叉污染的可能性。Bio-Rad也提供了类似的装置,名为Rotofor Cell,规格多样,但貌似用起来稍微复杂一点,而且价格更贵。

等电聚焦

在双向电泳中,为了获得最佳的电泳结果,我们必须不断优化样品制备和第一向等电聚焦的条件,以确保复杂的样品能够充分分离。而不同蛋白样品的最佳IEF条件可能相差甚远,因此必须单独摸索。

市场上大部分IEF系统都有多个通道,但各个通道的条件都是相同的,因此每次只能摸索一个条件。而传统的IEF槽将总电流平均分到所有通道。除非所有的样品有着相同的电导率,否则电流是不能平均分配的,最终每个胶条上的电流可能未达到或超过了理想的电流。这有可能引起聚焦不足或聚焦过度。

而Bio-Rad新推出的PROTEAN i12 IEF系统拥有12个独立通道,且每个通道都有自己的电源。这样,系统就能同时运行不同的样品类型、不同的聚焦条件以及不同pH范围的胶条,而不用担心不同样品会互相影响。这种独特的能力让您能在更短的时间内优化实验,提高实验效率,同时获得稳定的结果。对于有多个双向电泳课题的实验室而言,这确实是个好消息。

GE Healthcare的Ettan 2D系统也有两个新成员:IPGbox™ 和IPGbox Kit。IPGbox的设计经过改进,底座和上盖可以分离,更加友好和稳定,且不透明的盖子让水化在暗处进行,完全适合光敏感的CyDye DIGE荧光染料。上盖和插片的设计可保证胶条在水化过程中不会变干,无需再用覆盖油。同时一次性使用的水化盘和插片,也保证样品之间没有交叉污染。水化盘经过重新设计后,高疏水性材料保证溶涨液不会粘附在盘上,且水化液均匀分布在整个盘内,确保IPG胶条水化的一致性。

染色

对于2D凝胶的染色,银染是比较常用的方法,不过步骤多,流程长,操作复杂。而SYPRO Ruby荧光染料的出现被誉为蛋白质组研究中的里程碑。它的灵敏度可与最好的银染法相媲美(1~2 ng),线性动态范围可达3个数量级,而且它与质谱检测和Edman测序有很好的兼容性。SYPRO Ruby可一步检测蛋白,只需要30~60 min,不需要脱色步骤,相当方便。

目前有多家公司都提供样品制备试剂盒、IPG胶条、IEF电泳装置和第二向跑胶装置,包括GE Healthcare、Bio-Rad、Life Technologies等。但对于刚入门的同学来说,他们也许会纠结两个问题。

选择哪种胶条?

IPG胶条有多个pH范围可供选择,从宽到窄。例如,Bio-Rad的IPG胶条覆盖“宽”(3-10)、“窄”(3-6、5-8、4-7)和“更窄”(3.9-5.1、4.7-5.9、5.5-6.7、6.3-8.3)的pH范围。建议在宽范围分析完成之后,再进行窄范围的分析。如果是研究一个未知样品,宽的pH范围将带来一个样品概览。在您了解目的蛋白的大致位置后,才建议使用窄或更窄的pH梯度。

选择多大的胶?

选择多大的胶,这也是个问题。各家公司的2D凝胶大小不等,从9 cm x 7 cm一直到24 cm x 20 cm,而IPG胶条的长度也从7 cm到24 cm。一般来说,凝胶越大、运行时间越长,但分辨率越高。而另一方面,太大的胶很难操作。这就如同一个硬币的正反面,很难取舍。不过,如果你对自己的体力有信心,那就勇敢地使用大胶吧。

若你的双向电泳结果不理想,还可以参考一下生物通之前发布的《双向电泳常见问题解答》。(生物通 薄荷)

参考文献

1. Heywood, WE et al. 2D DIGE analysis of maternal plasma for potential biomarkers of Down syndrome. Proteome Science 2011, 9:56.

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