酶法组织消化技术[选购宝典]

从粗制的胶原酶到高纯度消化产品

【字体: 时间:2012年08月21日 来源:罗氏

编辑推荐:

  对于不同实验研究中分离的特定组织,需要根据经验来选择合适的胶原酶产品,并对酶浓度、酶体积、酶作用时间进行摸索,才能找到最佳的消化方案。让我们来听听罗氏专家的介绍和建议吧。

酶法组织消化中常用的胶原酶(Collagenase),能特异性地降解胞外胶原蛋白,使胶原蛋白和纤维粘连蛋白的网状结构解离,而不损坏细胞表面结构的完整性。由于细胞外基质的成分复杂,除胶原蛋白外,还含有弹性蛋白, 糖蛋白等其他大分子结构。而且不同组织类型,不同物种来源,不同年龄的组织中胞外基质组份不同。所以商业化的胶原酶产品一般是梭状芽孢杆菌裂解液的粗提物,是胶原酶、胰蛋白酶等蛋白水解酶混合物,能降解胶原蛋白和其他蛋白,及多糖等胞外大分子物质,适用于多种组织的消化应用。

但是对于不同实验研究中分离的特定组织,需要根据经验来选择合适的胶原酶产品,并对酶浓度、酶体积、酶作用时间进行摸索,才能找到最佳的消化方案。

罗氏胶原酶产品选择示例

罗氏胶原酶产品提取自溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum),并根据不同的酶活和验证的功能应用分为Collagenase A/B/D/P/H五类产品。被广泛应用于各种组织中(如肺、心脏、肌肉、骨、脂肪组织、肝、肾、软骨、乳腺、胎盘、血管、脑组织和肿瘤组织等)单个细胞的分离。应用其获得的细胞产量、活度和细胞功能性均经过严格的产品质量控制和验证。

罗氏胶原酶分类

主要酶组分

建议的组织应用(根据文献中的产品引用)

Collagenase A

胶原酶I型,胶原酶II型,梭菌蛋白酶,胰酶,中性蛋白酶

常规的酶混合比率,中度酶活

卵母细胞

肺细胞

Collagenase B

胶原酶I型,胶原酶II型,梭菌蛋白酶,胰酶,中性蛋白酶

中至高度胶原酶活性,较高的梭菌蛋白活性(>10U/mg

心肌细胞

软骨细胞

胚胎前驱细胞

Collagenase D

胶原酶I型,胶原酶II型,梭菌蛋白酶,胰酶,中性蛋白酶

中至高度胶原酶活性,极低的胰酶活性(<0.2U/mg

淋巴细胞

树状细胞

Collagenase P

高酶活胶原酶,梭菌蛋白酶,胰酶,中性蛋白酶

针对胰岛细胞分离的经验证产品

胰岛细胞

软骨细胞

T细胞

Collagenase H

胶原酶I型,胶原酶II型,梭菌蛋白酶,胰酶,中性蛋白酶

针对肝细胞分离的经验证产品

肝细胞

成纤维细胞

脂肪

小贴士:

如果您的组织在酶消化分散的过程中,出现胶状粘连细胞,影响细胞的分散,很可能是由于破碎细胞中DNA释放至胞外而导致的粘连,可通过DNase的加入使粘连的细胞获得更好的分散。

由于Collagenase粗酶中还含有各种不同的蛋白酶,如其中的淀粉酶和脂肪酶也会消化细胞表面的蛋白,对细胞造成一定的损伤。另外,粗制的胶原酶无法在不同批次产品间保持质量和酶活的一致性。即使针对同一种组织,使用不同批次的胶原酶进行消化,您仍需要对酶浓度、酶体积和酶作用时间进行优化。

那么如何使您的组织消化实验事半功倍呢?

罗氏Dispase®系列产品

罗氏Dispase®能用于多种组织和器官的原代细胞制备,由于其温和的特性,在消化过程中对细胞造成的损伤极小,它还能用于细胞的次代培养,也可用于细胞悬液中的聚团消化解聚。Dispase®是一种纯化的中性蛋白酶,提取自多黏芽孢杆菌(Bacillus polymyxa),杜绝了支原体污染的可能性,在宽泛的pH和温度条件下具有良好的稳定性,因此在组织消化过程中的表现比胶原酶更加稳定。

罗氏Dispase®尤其在皮肤组织的表皮分离和上皮层细胞培养中获得了广泛的应用。Dispase®I与Dispase®II两者的差别在于纯度的不同,Dispase®I经过滤除菌,且每mg Dispase®I的纯度和酶活远高于Dispase®II。

罗氏高纯度研究级别酶混合物 Liberase Research Grade Enzyme Blends

Liberase Research Grade Enzyme Blends包含了一系列酶混合物,它们由不同比例的中性蛋白酶(非梭菌蛋白酶)和高纯度Collagenase I + Collagenase II混合组成。在绝大部分应用中,Liberase能替换传统的胶原酶,并增加细胞产率、细胞活性和细胞功能性。

在严格的酶发酵和纯化工艺条件下,Liberase Research Grade Enzyme Blends去除了梭菌蛋白酶和胰蛋白酶等杂酶,去除了原料中>98%的内毒素和其他死细胞成分,因此有助于在组织消化过程中,大大提升细胞的活率。Liberase系列产品均经过滤除菌,具有高度的批间一致性,保证了整个实验阶段的消化质量和重复性。

Liberase系列产品

 胶原酶含量(mg/管)

胶原酶活性(Wünsch units/)

中性蛋白酶量

中性蛋白酶作用于组织的酶活性

中性蛋白酶类型

内毒素

(EU/mg)

Liberase DL

5mg

50mg

26

260

+

Dispase

≤50

Liberase DH

5mg

50mg

26

260

+++

Dispase

≤50

Liberase TL

5mg

50mg

26

260

++

Thermolysin

≤50

Liberase TM

5mg

50mg

26

260

中等

++++

Thermolysin

≤50

Liberase TH

5mg

50mg

26

260

+++++

Thermolysin

≤50

罗氏胶原酶与Liberase系列产品的替换比较

罗氏胶原酶

特性

Wünsch units/mg

相应活性的Liberase产品

Collagenase A

粗制酶混合物

0.15

Liberase TM

Collagenase B

粗制酶混合物

0.15

Liberase TH

Collagenase D

粗制酶混合物

0.15

Liberase TM

Collagenase P

粗制酶混合物

1.50

Liberase TL, Liberase DL

Collagenase H

粗制酶混合物

0.15

Liberase TM

小贴士:
1. Liberase系列产品根据胶原酶和中性蛋白酶的不同配比,分为不同消化活性的5种产品。您可以参考其他实验室的研究或已发表文献,进行合适产品的选择和操作流程参考。
https://www.roche-applied-science.com/sis/collagenase/index.jsp?id=col_030100
2. 对于新的组织细胞的消化尝试,建议从Liberase TM开始您的实验,Liberase TM的消化活性范围对各种组织具有良好的通用性。
3. Liberase中Collagenase I + II 的纯度很高,与常规胶原酶消化实验相比,通常需将孵育时间减少10 – 30%。

请注意:Liberase Research Grade产品和其他消化酶产品仅供生命科学研究和体外研究使用。请勿将此产品用于临床和诊断程序(如人胰岛移植)。

了解更多Liberase产品信息

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