高通量抗体筛选的均相抗体结合实验[创新技巧]

【字体: 时间:2012年08月03日 来源:腾泉

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  尽管ELISA和流式细胞仪等传统手段被广泛应用,但是这两种检测手段都存在很多的局限性,特别是对细胞表面低丰度抗原的检测。为了解决这些技术瓶颈,我们开发了mirrorball这个高灵敏度检测平台和“即混即读”的实验方案,这样就大幅度的提高了抗体筛选的通量并且避免了繁琐的实验步骤。

以抗体技术为基础的免疫检测应用和相关的疾病治疗领域如癌症,自发免疫紊乱等一直推动着抗体筛选研究的发展。单克隆抗体是会由特定的细胞系分泌到上清液中,而对上清液的筛选则成为了药物研发的核心领域。

均相结合实验

尽管ELISA和流式细胞仪等传统手段被广泛应用,但是这两种检测手段都存在很多的局限性,特别是对细胞表面低丰度抗原的检测。同时,这两种平台需要很繁琐的洗板和孵育的步骤而且耗费大量细胞和时间才能获取数据。为了解决这些技术瓶颈,我们开发了mirrorball这个高灵敏度检测平台和“即混即读”的实验方案,这样就大幅度的提高了抗体筛选的通量并且避免了繁琐的实验步骤。您所需要进行的实验仅仅是将所有的反应物一次性的加入到孔中并孵育一段时间。这里待检测的可以是结合在微球上的可溶性抗原也可以是细胞表面表达的抗原,一旦反应达到平衡状态,那么结合了一抗的珠子和细胞可以很快的通过荧光标记的二抗来检测到。由于mirrorball的这种高灵敏度特性,使得我们可以比流式和传统ELISA更早的检测样品,并且只需要5ul左右的待测样品。均相反应体系可以大幅度的减少试剂的消耗,特别适用于研究昂贵和低丰度的抗原。

均相抗体结合实验的分析

mirrorball和ABI 8200 FMAT 都在设计上融入了很多适用于均相结合实验的特性。通过使用激光作为激发光源和光电倍增管作为检测装置,这使得它们能够检测到低亲和力的抗体和低丰度的抗原的结合。两个系统都在光路设计上最大程度的降低了背景荧光并在扫描读数的时候大幅度的提高了信噪比。在这个应用介绍里我们特别的比较了两个平台 mirrorball和ABI 8200 在通过细胞水平实验进行抗体筛选时的性能优异性。通过对比,我们展示了mirrorball的多重荧光检测能力,这使多重抗原标记并同时检测成为了可能。

方法

细胞系和培养方法
在这项研究中,比较了mirrorball和ABI8200系统在进行A431细胞EGFR抗体结合实验时的。 A431细胞在EMEM培养(EBSS)(Sigma公司)含10%胎牛血清,2mM谷氨酰胺(Sigma公司),1X非必需氨基酸(NEAA)(Sigma)和100 U / mL青霉素以及100 U / ml链霉素。 A431细胞培养至80%汇合度时用0.25%胰蛋白酶和EDTA收集,洗净悬浮在培养基中。除非另有说明,培养试剂均购自Life Technology。

抗体和试剂
检测抗体,鼠抗人表皮生长因子抗体(抗EGFR抗体),购自Merck Chmicals Ltd(#GR01)。山羊抗鼠IgG,AlexaFluor647 (#A21235)由Life Technologies公司提供。

CFSE标记
5(6) - 羧基二乙酸N -琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Sigma公司)配置为100mM在DMSO溶液里。 CFSE(10nM)被添加到细胞里并在室温中孵育10分钟。用4%FBS的PBS(2ml)终止反应。进一步孵化,于37° C下10分钟后,细胞1000 x g离心5分钟。

EGFR实验
抗EGFR抗体在培养基中梯度稀释,并添加20ul到384孔板中(Costar#3712)。对于mirrorball系统,暂停用CFSE标记A431细胞含有1 ×105个细胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647二抗。对于ABI的8200平台,准备A431细胞的悬浮液包含4× 105细胞/ mL和6nM抗鼠IgG AlexaFluor647。首先,加入在各孔中加入20uL混合有荧光二抗的细胞悬液在37℃,孵育2小时。分别在mirrorball和ABI8200平台上进行扫描并测定结合有EGFR抗体的细胞数量。最后,mirrorball和ABI8200的浓度分别为2000细胞/孔和8000细胞/孔,3 nM抗体结合(图1)。

图1. mirrorball表皮生长因子受体检测示意图。ABI 8200的实验protocol基本一致,除了加入的A431浓度为4× 105细胞/ ml。

mirrorball的数据扫描和获取
微孔板进行扫描时使用488nm和640nm的激发光。使用TTP LabTech公司专利的阈值算法和两种形态荧光参数,每孔中的细胞都会 “on-the-fly”。。而使用mirrorball的图像Cellista™软件,我们可以进行全景扫描,得到数据可视化中的各种数据图形(包括直方图或散点图,3D荧光强度分布图)和整个微孔的图片。

ABI 8200的数据扫描和获取
使用640 nm激光扫描样品,进行细胞计数和荧光总强度检测,数据导出到Excel文件和处理。实验数据仅仅收集了孔中心1 mm2面积区域。

数据结果

为了比较mirrorball和ABI 8200在EGFR检测灵敏度方面的差异性,将A431细胞与梯度稀释的EGFR一抗以及AlexaFluor647标记的goat anti-mouse IgG二抗共同孵育。 在用mirrorball分析时,用CFSE对细胞进行染色,预先定位细胞并进行计数,细胞量为384孔板每孔2000个。对于ABI的8200, A431细胞量为每孔8000个接种。

图2表明,mirrorball检测灵敏度和ABI 8200 一样,从5 ng /ml抗EGFR抗体浓度开始,荧光随着浓度升高而逐渐加强。两种方法在一抗浓度高于100ng/ml的时候,都检测到了一个较强的荧光减少。这也是报道过的 “钩状效应”(2)。在这里,主要是过量的一抗过饱和了,阻止了荧光二抗的结合和最终的实验读数。

图2 抗EGRF抗体和 A431细胞结合的抗体浓度依赖的荧光强度曲线


mirrorball的多激光能力提供了一个独有的优越性,对细胞的识别不会受到较低丰度抗体结合的影响。而ABI 8200只配备了单一的640 nm激光,因此也只能检测高过背景的荧光。然而,在使用mirrorball 时由于用CFSE(488nm)染料对细胞进行单独染色,细胞的计数就不再依赖荧光抗体的结合。可靠的细胞计数也同时增加了数据的稳健性。

图3 mirrorball允许不依赖荧光抗体的结合量来测量CFSE标记的细胞。而在ABI 8200平台上,细胞必须有荧光抗体的结合才能被检测的到

mirrorball不仅具有和ABI 8200一样的高灵敏度,而且与ABI 8200只能扫描1 mm2的区域相比,它能够扫描整个孔内的细胞并且不受细胞分布的影响(图4)。由于ABI 8200的扫描区域有限,往往需要较高的细胞数目来获得更具有统计学意义的结果。

图4 mirrorball和ABI 8200扫描区域的对比

使用mirrorball 可以大幅度的减少每孔中细胞的用量,这对一些生长缓慢数量较少的细胞系特别适用,可以节省实验的消耗。

mirrorball的软件cellista能够像ABI 8200一样进行数据处理并直接呈现出hit孔的位置,这个功能使我们可以兼容之前ABI 8200上的实验数据。这里EGFR实验就是个很直接的案例,不需要改变现有的protocol就可以直接在mirrorball上进行实验。

图5 使用每个珠子或细胞的平均荧光强度来代表hit

讨论

均相反应和“即混即读”实验特别适合生物医药研发,尤其是抗体药物筛选实验。因为这种实验能减少洗板和孵育的次数并增强检测的灵敏度,对比传统的ELISA大大缩短了实验时间,提高了实验通量。同时也要比流式细胞仪等仪器更有优势,也可以减少细胞和试剂的用量。

这里我们比较了mirrorball和ABI 8200的检测灵敏度,实验结果表明mirrorball的灵敏度同样优异,可以将原有在ABI 8200上进行的实验直接转移到mirrorball上进行。

mirrorball是第一台能够完成多重激光同时扫描的仪器,能够同时将不同荧光关联起来。当使用不同的荧光染料的时候,特别是应用在抗体筛选的实验时候,这种特性就能提供卓越的多重荧光的检测能力,包括同时检测多种抗原或者同时检测不同标记的细胞表面抗原的能力(例如,野生型和转基因细胞系)。

总体上,TTP Labtech的mirrorball 微孔板细胞仪的“即混即读”检测方法能够为可溶性抗原或细胞表面抗原的检测提供最稳健的数据结果。自动化的抗体筛选技术整合混合即读数的实验方式,将高灵敏度检测和高内涵抗体筛选有机结合起来,可以提高药物筛选的效率。因此,mirrorball也是一个非常理想的ABI 8200的替代产品,将成为下一代的抗体筛选平台。

文献
1. Bowen, W. and Wiley, P. (2006) Application of Laser-Scanning Fluorescence Microplate Cytometry in High Content Screening. Assay and Drug Development Technologies 4: pp209-21
2. Lee, R., Tran, M., Nocerini, M. and Liang, M. (2008) A High-Throughput Hybridoma Selection Methods Using Fluorometric Microvolume Assay technology. J. Biomol. Screening 13: pp210-17.

配置说明
TTP Labtech mirrorball 是一台高灵敏度的微孔板细胞分析仪可以用于多种荧光的检测实验。mirrorball可以应用于多重细胞和磁珠水平的筛选试验,可以装备多种激光并且支持多通道的荧光采集。

检测技术

激光扫描荧光检测

激发激光

多至3种不同固态激光(405nm488nm640nm

多荧光检测

245种不同荧光同时检测 ,配有光电倍增管

激光衍射检测

用于珠子表面包被的抗原

微孔板类型

963841536孔板

扫描面积

全孔

通量

1520分钟无论微孔板的类型

软件

Cellista

数据输出

Cellista plate文件CSV,FCSTIFF 16

PC控制系统

Microsoft® Windows

配置

单独放置并支持与其它加样工作站整合

激光安全级别

1

体积

645mm 513mm 350mm W*D*H

重量

60Kg

电源

110/230 V 直流47/63 Hz 800W

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