Western Blot实验操作指南优化(下)

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2012年08月30日 来源:生物通

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  大多数研究人员并不是Western blot技术专家——他们要解答的是更大的问题,问题是大多数人都不知道何处需要优化。坦率地说,Western blot检测过程耗时太长。如果每个印迹实验都有花费你两天时间,那么还有多少时间确实能用于优化Western blot呢……

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  Caitlin Smith撰写/张迪编译

生物通报道:Western Blotting依然是目前分离和检测蛋白最常用到的一种技术方法,但是要将这种技术变成你的有利手段,并不容易。因此优化实验操作手册至关重要,但是,正如Bio-Rad成像系统市场经理Ryan Short所说的,“大多数研究人员并不是Western blot技术专家——他们要解答的是更大的问题”,Ryan继续说道,“问题是大多数人都不知道何处需要优化。坦率地说,Western blot检测过程耗时太长。如果每个印迹实验都有花费你两天时间,那么还有多少时间确实能用于优化Western blot呢?”当然,类似抗体质量,封闭液和转印效率等因素也扮演了关键角色,让我们来仔细看看,现今还有哪些优化的技巧和工具。

上篇:

Western Blot实验操作指南优化(上)

Western Blot实验操作指南优化(中)

加州大学戴维斯分校神经生物学系助理教授Aldrin Gomes的实验室采用Bio-Rad的V3 workflow,表示这一系统为他们节省了许多时间,“我们还可以利用这一印迹系统做更多的实验,”他说,“在此之前,我们只能做两个blot。而采用Turbo Blot,我们可以一次跑4块迷你胶(或一大两小)。这使得我们能够尝试不同的条件,所以我们可以更快的优化,比如,我们可以调整转印时间(5分钟vs7分钟),或尝试不同的百分比凝胶“。

Mischnick赞同认为blot优化中最大的局限之一就是时间。“完成并检测WB,可能需要长达8小时,”她说,“LI-COR的Quick Western Kit-IRDye 680RD 能结合一抗反应这一步骤,无需二抗,提供一个通用性抗体检测试剂,并节省最多90分钟的总检测时间。”此外,这一试剂盒还包含有不同的一抗,从而免除了购买多个IRDye二抗的需要。

多功能和自动化解决方案

同时运行检测多个样品,可以加快优化的步骤,这能帮助研究人员在不同条件下或不同蛋白浓度的样品中进行实验。LI-COR MPX (Multiplex) Blotting System 在一次WB中能筛选多个样品和靶标。“MPX独立通道和多重采样功能避免了,标准的Western blot分析过程中遇到的关于抗体交叉反应的限制,”Mischnick说,“MPX的实验指南为客户提供了在一个实验中对所有检测元素,优化Western blot检测条件的方便。”

而针对高通量的优化,ProteinSimple的Sally就是一款全自动Western blot仪器。利用这个仪器,研究人员只需将蛋白样品加入到一块384孔板中,然后把板放入仪器。其余的就交给Sally。“仪器引导蛋白进入毛细血管,这相当于蛋白道,那儿我们分离蛋白,”ProteinSimple 公司的发展总监John Proctor说,“仪器可以完成免疫检测和二抗分析,然后输出所有图片。用户将会得到一系列的图像——它会告诉你所有的毛细血管不同的数据。”

Sally系统还具有其它方面的优势。传统的WB一次只能加入一种一抗,但是Sally可以使用多个一抗,在每个或者穿插毛细血管中都可以用到几个一抗,“例如,Sally系统同时可以运行96个毛细血管,这意味着你在一个实验中针对相同的样品,跑96个一抗反应”,Proctor说,“这将给使用不同一抗,不同样品类型,不同二抗,带来了很大的灵活性。因为有这些许多毛细血管,研究人员就可以进行象限,矩阵或不同的条件的分析,从而在一次实验中,得出一个最终全面优化的分析。

不过Sally系统也存在缺陷,那就是速度,这个系统完成的高通量实验需要时间——96毛细血管需要18-19小时,或overnight。

ProteinSimple的低通量仪器:Simon则能在在3-5个小时中运行12个毛细血管。“Sally运行的时间与传统的WB时间相当,不过现在我们也在进一步将其速度提升,也许5-6个小时吧”,Proctor说。

结语

无论选择的是传统的WB,抑或是高通量WB系统,要想进行良好优化,其中最重要的一个方面就是知道你自己正在尝试做什么,以及为什么。

“重要的是要真正了解所有的技术背后的基本原则和步骤,”Bochariov说,“如果研究人员不理解这些机理和机制,那么就很难看出一个真正能获得发现的优异改进,和仅仅实验伪像之间的区别。”
 

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