SYBR法实时定量PCR优化指南

【字体: 时间:2012年09月05日 来源:生物通

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  SYBR Green法实时定量PCR比探针法成本低,使用也更为方便。不过该方法也存在着与生俱来的弊端,SYBR Green法产生的非特异性产物较多,会导致高背景和假阳性。当然供应商们也各展所长,开发了各式各样的产品来帮您优化这一qPCR的经典方法。

SYBR® Green是一种插入DNA分子的染料,具有多种分子生物学应用,其中之一就是用于实时定量PCR(qPCR)。随着PCR循环的连续进行,这种染料的荧光强度会不断增强,从而可以使人们对反应中的DNA进行定量。SYBR Green法及一些其他基于染料的qPCR方法比探针法的成本低,使用也更为方便。不过这些方法也存在着与生俱来的弊端,SYBR Green方法产生的非特异性产物较多,会导致高背景和假阳性。尽管如此,SYBR Green法这一久经考验的技术仍然颇为流行,有大量的研究人员是SYBR Green法的忠实拥护者,愿意接受这一技术的小瑕疵。当然供应商们也各展所长,开发了各式各样的产品来帮您优化这一qPCR的经典方法。

热启动的长处

热启动PCR方法能够在反应开始前避免非特异性扩增。热启动技术一般是依赖经修饰的酶、引物或者抗体对聚合酶进行抑制,直到系统达到变性温度。

Sigma公司生命科学部qPCR试剂全球产品经理Eric Reyes称,该公司最新的热启动产品KiCqStart™ SYBR Green qPCR ReadyMix™比同类产品性能更优,并且可以针对如今试验室中的各类实时定量PCR仪提供相应配方的产品。KiCqStart SYBR Green ReadyMix产品是2X浓度的即用型试剂,包括SYBR Green I、抗体介导的热启动Taq DNA聚合酶、核苷酸和MgCl2,外加缓冲液和稳定剂。该产品只需客户加入引物和模版,免去了繁复的SYBR Green优化流程,实际上该产品也的确不需要进行优化。

较难扩增的目标

有些目标较难扩增,为了解决这一问题,Life Technologies公司近期发布了SYBR Select Master Mix。依据Life Technologies基因分析产品主管Sobha Pisharody的说法,该产品的最大优势在于特异性和可重复性更高,超越了目前市面上的其他SYBR混合液。SYBR Select包括一个热不稳定性尿嘧啶糖基化酶UDG,用于去除可能干扰扩增的污染模板。“混合液中含有UDG可能造成一些问题,”Pisharody说。“有时甚至会破坏反应,因为它并不总能一受热就灭活。”

dUTP的利与弊

扩增产物有时会影响后续PCR反应,导致假阳性结果。控制这种情况的方法之一就是在PCR产物中用dUTP取代dTTP,随后再用UDG处理所有的后续反应。UDG能够将尿嘧啶从其磷酸二酯主干上切除下来,但不影响天然DNA

热不稳定性UDG在完成清理任务后,可以受热自动失活。“这一产品能使客户的实验更容易获得成功,”Pisharody说。“客户使用SYBR遇到的主要问题之一,是需要反复进行引物设计、试验、重新设计引物,而这一混合液的特异性可以帮助人们大大简化这一过程。”

不过,dUTP方法也存在着缺陷。只有当同一个仪器上的所用用户都使用dUTP清理系统时,该方法才有效。即使该研究组中只有一位成员不使用dUTP清理系统,这种控制方法就会失效。此外使用dUTP被认为是一种低效率的方法,因为dUTP会使反应的效率降低,Ct值增大。

Meridian生命科学公司旗下的Bioline就因此不再销售带有dUTPPCR试剂盒。该公司向用户推荐了一种优化步骤,包括使用一次性耗材、带过滤芯的吸头以及分隔扩增区域,将洁净的实验室操作与高特异性的实时定量PCR联系起来。BiolineSensiFAST™系列试剂盒不仅提供用于SYBR Green法的实时定量PCR产品,同样也提供探针法产品供您选择。

快、还要更快

目前,许多实验室都在寻求qPCR的快速方案,例如将两小时的实验方案缩短至45分钟或者1小时。快速PCR通常意味着价格水涨船高的仪器和不菲的资金投入,不过其实调整标准仪器的参数也能够实现快速PCR,例如可将qPCR的标准三步流程合并为两步(合并退火和延伸过程)。而相应的试剂和耗材(例如新型热启动酶)也能帮您进一步节省时间。

Bio-Rad公司的SsoAdvanced™ SYBR Green supermix中包含与双链DNA结合的蛋白Sso7d融合酶,这种酶能够稳定聚合酶-模板复合物,提高PCR反应的持续合成能力、抑制剂耐受力和反应速度。Bio-Rad的资料显示,这一混合液能够提高qPCR的速度而不会对反应的特异性、敏感性和效率产生丝毫影响。

此外,Bio-Rad公司还提供iTaq™ Universal SYBR Green Supermix。“这种SYBR Green supermix的优势在于,它的仪器兼容性非常广泛,并且能够在多种反应条件下生成优异的qPCR数据,”Bio-Rad PCR试剂产品经理Ramesh Sathiyaa介绍道。

Thermo Scientific公司的DyNAmo™ Flash SYBR Green qPCR试剂盒也是一款专门为快速PCR设计的产品。该产品依赖于经过修饰的Thermus brockianus DNA聚合酶,将这种酶的热启动版与SYBR Green I染料相结合。该公司的技术人员通过非特异性DNA结合域的融合使T. brockianus聚合酶更加稳定性,并且在室温下不具活性。该试剂盒的ColorFlash版更整合了特殊染料,其中master mix含有蓝色染料针,而样品缓冲液含黄色染料(样品孔),这样当样品和master mix混合后就会呈现绿色。这一颜色体系可以确保移液的正确性,帮您轻松告别加样失误。

替代品

罗氏公司的技术服务顾问Joe Donnehoffer正在尝试引导客户放弃SYBR Green,“如果客户正在使用SYBR Green并且需求用于降低非特异性的产品,我们会推荐他们使用UPL通用探针库”。

Donnehoffer还向强烈执着于SYBR Green的客户推荐了一款替代性染料,LightCycler 480 ResoLight Dye。与SYBR Green不同,ResoLight能够充满DNA分子片段,生成准确的熔解曲线。而SYBR Green I分子就无法做到这一点,染料分子在解链阶段会在DNA链之间“跳跃”。

Donnehoffer也提到人们对于SYBR Green的偏爱可能较难改变。“使用SYBR Green的客户……并不情愿采用另一种不同的方法。”因此,他也并不指望SYBR Green会在近期退出实验室的应用舞台。

Life Technologies公司也有相应的替代性染料提供,该公司的SYBR GreenER™SYBR Green I更亮,对PCR反应的抑制也更小。

预证引物

正所谓成也萧何败萧何,引物设计在一个qPCR实验中非常关键。实际上您可以在引物数据库中寻找适合自己的引物设计,这类数据库包括RTPrimerDBPrimerBankqPrimerDepot等,其中的引物设计都是被验证过的。

市面上也有不少预证引物的产品。例如Qiagen公司的QuantiTect Primer Assay就是特别为SYBR Green法设计的qPCR引物对,具有高度的敏感性和特异性,PCR效率能达到100%。该产品系列覆盖了人类、大鼠、小鼠、果蝇、拟南芥等物种的基因,更经过专家的反复验证和优化,与Qiagen公司的QuantiFastQuantiTectRotor-Gene或者FastLane SYBR Green试剂盒一同使用实验结果就更有保障了。根据Qiagen公司的资料,即使在标准qPCR仪上使用,QuantiFast SYBR Green试剂盒也能帮您省下60%的时间。

OriGene公司也有预证引物产品提供,其SensiMix qPCR引物对就能用于SYBR GreenqPCR,该产品也是OriGene公司独有专利算法的结晶。OriGene公司的预证引物产品覆盖了人类和小鼠的整个基因组。

此外,Sigma公司也发布了为人类、小鼠和大鼠转录组设计的KiCqStart预证引物,Sigma公司OEM、分子诊断和qPCR探针的全球产品经理Tom Russell介绍道。这些引物比市面上的其他预证引物更经济,购买该产品也更为便利,“我们在世界各地都设有生产机构,”Russell说。

qPCR复杂冗长的优化过程中,往往需要不断进行实验,逐步改进引物设计,甚至重复订购试剂,不知不觉就耗费了我们大量的时间和精力,从这方面看预证引物和试剂盒绝对是物超所值。

Catherine Shaffer撰写/yeyu编译)

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