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NEB NGS文库制备产品之使用体会[心得点评]
【字体: 大 中 小 】 时间:2013年02月01日 来源:生物通
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New England BioLabs(NEB)公司推出了30多款样品制备方面的产品(NEBNext系列),适合Illumina、454、Ion Torrent等多个平台。NEBNext DNA Sample Prep Master Mix Set for Illumina 是一款文库制备产品,适用于后续的定向富集或在Illumina的HiSeq或MiSeq平台上直接测序。这款试剂盒的效果如何?且看本文。
目前几乎所有的新一代测序(NGS)平台都通过相同的原理来制备模板,包括目标DNA的随机片段化,加上平台特异的接头序列。可别小看了文库制备,它的质量决定了后面测序数据的好坏,因此切不可掉以轻心。除了测序仪的制造商,现在也有很多公司推出了NGS文库制备方面的产品。
New England BioLabs(NEB)公司就推出了30多款样品制备方面的产品(NEBNext系列),适合Illumina、454、Ion Torrent等多个平台。NEBNext DNA Sample Prep Master Mix Set for Illumina 是一款文库制备产品,适用于后续的定向富集或在Illumina的HiSeq或MiSeq平台上直接测序。试剂盒中包含了末端修复、加A尾和接头连接所需的全部试剂。不过,接头需要单独购买。
这款试剂盒的效果如何?奥地利格拉茨医科大学人类遗传学研究所的博士后Ellen Heitzer将它与Illumina的TruSeq Sample Preparation Kit进行了比较。
她的样品是来自HCT116和HT29结肠癌细胞系的DNA。她们用Chemagen DNA Kit(Perkin Elmer)或QIAamp DNA Micro Kit(Qiagen)从细胞系中提取出DNA。利用Nanodrop对DNA进行定量后,再利用Covaris系统将1 µg DNA剪切到大约300 bp。
之后她们按照说明书,利用NEBNext试剂盒或TruSeq试剂盒进行文库制备。过程大致如下:DNA通过超声处理打断成300 bp。接着通过补平反应和核酸外切酶活性修复片段末端,再加上A尾。连接Illumina特异的接头,再利用AMpure XP磁珠(贝克曼库尔特)来去除未连接的接头。最后是10个循环的PCR,富集连上接头的片段。
Heitzer在安捷伦的生物分析仪DNA 7500上评估了文库的数量和质量。之后从每个文库取500 ng,合并后进行370个癌基因的定向富集。这一文库,包括两个富集的HT29文库(NEBNext和TruSeq)以及两个富集的HT116文库(NEBNext和TruSeq),在Illumina MiSeq上测序。
结果是,两个文库制备试剂盒都产生了高质量的文库,且平均大小在300-400 bp,适合150 bp的末端配对测序。两个试剂盒的产量都很高,且能直接进行定向富集。这4个文库都获得了相当量的读取,且质量评分很高,使所有样品的平均覆盖度达到150倍。在TruSeq文库中发现的所有变异也在NEBNext文库中找到。测序准确性证明了这两个试剂盒所构建文库的高质量。
Heitzer认为,NEBNext的优势在于,假如某些试剂用完,你可以单独订购试剂盒中的所有模块。此外,这些模块也让您能够定制样品制备,满足您的个性化需求。而且,NEBNext相对TruSeq,价格会便宜一点。当然,缺点就在于接头不包括在内。
综上,她们认为NEBNext文库制备过程与Illumina的流程高度兼容。文库制备过程至少与Illumina过程一样好。
同时,Heitzer还贡献了一些文库制备时的tips。在片段化时,酶切片段化不可能像机械法那么随机,因此她建议使用Covaris系统进行DNA片段化。同时,她也强烈建议使用AMpure XP磁珠来进行纯化和size selection。不过,如果样品质量不高(如FFPE),最好还是用凝胶法。
小编补充:这个试剂盒还有个优点,就是到货快。NEB备有现货,让你不再需要翘首盼望4-6周。它有两种规格:12次和60次,价格分别为:4,209元和16,809元。(生物通 余亮)