BioTechniques：如何选择甲基化分析？

在DNA甲基化研究中，基于PCR的方法应用最为广泛。然而，随着新方法的不断涌现，大家不免有些眼花缭乱。如何选择最适合的方法，这对新手而言可是个难题。近日，哥伦比亚的研究人员在《BioTechniques》杂志上发表文章，介绍了最常用的DNA甲基化分析方法，并具体分析了每种方法的优点和缺点。

DNA甲基化是研究最为深入的表观遗传基因调控。研究表明，它在多个生理过程以及常见病中发挥重要作用。目前，研究DNA甲基化的平台有很多种，这为希望踏入此领域的研究人员带来了困扰。于是，文章作者介绍了一些常用的方法，包括亚硫酸氢盐测序PCR（BSP）、甲基化特异性PCR（MSP）、MethyLight和甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS-HRM）。作者认为，这些技术不需要昂贵的仪器，适合在普通的分子遗传学实验室开展。

作者首先介绍了亚硫酸氢盐转化，这几乎是所有DNA甲基化分析的第一步。经典方法比较耗时，通常需要16小时才能完成，而且需要多次换管，增加了污染的风险。市售的试剂盒通过缩短孵育时间和改变纯化步骤来改善转化后DNA的回收。因此，对于新手而言，强烈建议使用试剂盒。在选择试剂盒时，可考虑多个因素，包括成本、产量、效率和时间。文章也列出了多款试剂盒的比较。

作者认为，在DNA甲基化研究之前，还应该评估一下转化后DNA的质量，这一步对定量方法特别重要，如MethyLight和MS-HRM。亚硫酸氢盐处理可导致DNA片段化，因而会减少PCR扩增后的分子数。最好还是用各种引物组检验一下，确定最理想的扩增子长度。

之后作者详细介绍了各种方法的原理、操作、优点及缺点，包括各种BSP方法、MSP、MS-HRM及MethyLight。以经典MSP为例，这种方法经济实用，灵敏度高，但不是定量的。分析只给出三种结果：甲基化等位基因的存在；未甲基化等位基因的存在；这两种等位基因的存在。此外，低质量的DNA也与重复性降低有关。不完全的亚硫酸氢盐转化会导致假阳性结果。

他们认为，全基因组分析平台有许多优势，但PCR方法实现了基因组中特定位点的详细分析，如CpG岛。此外，焦磷酸测序也是一种定量方法，不需要克隆，但存在PCR偏向，而且仪器也比较少。

这篇文章可以免费阅读。若您有意开展DNA甲基化分析，那切不可错过这篇好文章。（生物通 薄荷）

原文检索

Optimizing methodologies for PCR-based DNA methylation analysis

BioTechniques, Vol. 55, No. 4, October 2013, pp. 181–197