生物通 | 新技术专栏

从互作揭开lncRNA的秘密(上)

【字体: 时间:2013年11月28日 来源:生物通

编辑推荐:

  近年来,长非编码RNA(lncRNA)得到了研究界的广泛关注。如今,人们已经鉴定了大量lncRNA,但大多数lncRNA的功能还未明确。为了解决这一问题,研究者们开始对lncRNA的互作蛋白进行研究,并为此开发出了越来越多的分析工具。

生物通报道:西方有这样一句老话,通过一个人的朋友就可以判断他的为人,这句话同样适用于生物分子。如果你想知道某个生物分子的功能,可以从与它相互作用的分子入手。

近年来,长非编码RNAlncRNA)得到了研究界的广泛关注。如今,人们已经鉴定了大量lncRNA,但大多数lncRNA的功能还未明确。为了解决这一问题,研究者们开始对lncRNA的互作蛋白进行研究,并为此开发出了越来越多的分析工具。

RIP

RNA结合蛋白免疫沉淀技术又称为RIPRNA immunoprecipitation),可以说是RNA版的ChIP(染色质免疫沉淀),该技术能帮助人们分析与RNA结合蛋白相关的核酸。

RIP试剂盒(如SigmaImprint® RNA Immunoprecipitation kit)的帮助下,研究者们能够利用针对RNA结合蛋白的抗体,从细胞提取物中捕获与蛋白相结合的RNA,再通过qPCR、芯片或二代测序技术对这些RNA进行鉴定。

不论是细胞质还是细胞核,都会发生RNA与蛋白的相互作用。据Active Motif公司产品经理Kyle Hondorp介绍,该公司的RNA ChIP-IT® kit专用于研究RNA与细胞核染色质的相互作用。该试剂盒通过甲醛固定来锁定RNA-染色质的互作,随后对染色质进行超声,并用DNAse I处理,最后利用磁珠进行沉淀。

“如你研究的是总mRNA,那么常规RIP试剂盒更合适一些,”Hondorp说,“常规RIP试剂盒可以处理所有细胞裂解物的总mRNA。”

生产Magna RIP™ RNA-binding protein immunoprecipitation kitEMD Millipore公司,也在开发专门针对染色质的RIP试剂盒。预计这一新产品将于2014年第一季度发布,该产品有化学交联与native两种形式。据介绍,化学交联可以分析究间接的蛋白-RNA相互作用,研究更高分子量的蛋白复合物。而native方法展现的是,亲和力更高也更为直接的相互作用。

RIP以外,CLIPUV crosslinking and immunoprecipitation)也可以帮助人们捕捉与RNA结合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交联与核酸酶消化,不仅允许对RNA-蛋白复合物进行进一步的纯化(如凝胶电泳片段分离),还能够揭示RNA-蛋白互作所发生的位点。最近人们又开发出了新型CLIP 技术——iCLIPindividual-nucleotide resolution CLIP),该技术能够以单个碱基的分辨率,来展示RNA-蛋白互作的详细信息。

据伦敦大学学院的Jernej Ule教授介绍,CLIPRIP的关键性差异,在于沉淀复合物后的凝胶纯化步骤。CLIP技术可以给RNA-蛋白复合物的RNA末端带上放射性标记,并将这些复合物进行SDS-PAGE分离,之后转移到一张膜上。这样的过程可以提高纯化的特异性,减少非特异性的RNA。蛋白酶消化可以将RNA从膜上解离下来,用于制备cDNA文库,以备测序分析。

CLIP要比RIP麻烦一些,不过我认为它很值得采用,”Ule说。“放射性信号的量及其特异性,能够帮助我们提高cDNA文库的质量,最终得到准确实用的数据。”

ChIRPCHARTRAP

如果你对某种RNA感兴趣,希望研究与其发生相互作用的蛋白,就需要采用新的实验方案。ChIRPchromatin isolation by RNA purification)、CHARTcapture hybridization analysis of RNA targets)和RAPRNA antisense purification)都基于同样的理念,将与目标RNA互补的寡核苷酸进行生物素标记,并由此捕获相关蛋白。之后研究者可以通过二代测序或质谱分析,来鉴定与RNA互作的蛋白,明确发生这些互作的基因组区域。

NEBG. Brett Robb介绍,上述三种方法解决了当今RNA生物学中的关键需求。目前,研究者们已经鉴定了大量的lncRNA,但却不清楚它们的功能。“解决这一问题的途径之一,就是寻找与这些RNA发生互作的蛋白。”举例来说,加州理工学院的Mitchell Guttman和宾州大学的Jeannie Lee,就分别在使用RAPCHARTXist lncRNA展开研究。

据悉,目前ChIRPCHARTRAP技术都还没有商业化。不过有一个试剂盒可以实现从已知RNA分离蛋白,即MBL InternationalRiboTrap系统,该系统能够利用体外转录的RNA(带生物素标记),从细胞提取物中分离与之结合的蛋白。

 

下接:从互作揭开lncRNA的秘密(下)

 

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器云展台 | 免费试用 | 今日视角 | 新技术专栏 | 技术讲座 | 技术期刊 | 会展中心 | 中国科学人 | 正牌代理商

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号