NanoDrop超微量紫外可见光分光光度计的应用（一）

NanoDrop在Real-time PCR中的应用

简介

Real-time PCR的方法已经成为了基因表达定量的金标准。这里有两个重要的注意事项：一是在cDNA反转录之前，将RNA的量均一化，以保证得到的cDNA是均一的；二是确认选择的内参基因是可靠的。充足的RNA量是得到高质量且重复性好的数据的保证。这里描述的是用NanoDrop对RNA含量均一化后，再反转cDNA的方法。

前言

基因表达定量实验已经成为分子生物学实验室的主流实验。反转录PCR（RT-PCR）是根据RNA的序列反转录成cDNA的过程。Real-time PCR使用专门的仪器（荧光定量PCR仪），捕捉每个PCR反应后释放的荧光信号，对PCR扩增产物进行实时检测。

合适的引物、可靠的试剂和稳定的仪器紧密配合，对获得高质量的数据至关重要。因为Real-time PCR有许多的步骤，所以前期的质控对于获得可靠的结果是关键。据普遍的经验来看，遵守前述这两个Real-time PCR的注意事项，都能获得高质量的数据。

基因表达定量研究的目的是比较基因在两组样品间的表达情况。比如：比较不同细胞系或组织基因的表达情况，研究药物处理后不同时间的样本和未处理的对照组间基因表达的不同，检测病变和正常组织间基因表达的变化等。

Real-time PCR的数据一般会使用内参基因并使其均一化，内参基因一般是选择合适的管家基因，即在该次的实验条件中，对于同样的细胞数量，该管家基因的表达水平不会在实验组间发生变化。

为了确定内参基因在该实验条件下是否发生变化，我们必须在预实验中，对内参基因进行定量分析，因此需要保证加入的RNA量是一致的。

接下来我们将用NanoDrop对每个反应加入的RNA量进行均一化。以U6 RNA表达为例，用Real-time PCR的技术分析33个人类肝组织样本。cDNA合成，RNA提取和PCR的基本原则将不再描述。

RNA分离和定量

1．本次实验中有33个人类肝样本，其中18个为肝硬化病人的样本，另外15个为正常人的样本。本次实验的目的是探究某几个感兴趣基因在肝硬化与非肝硬化的样本中的表达是否有差异。但**步得确认其中一个内参基因在肝硬化和正常样本中的表达情况，即内参基因是否可用。

2．将冰冻的肝组织放入不锈钢的研钵中，倒入液氮研成粉末，用Trizol试(Invitrogen)，按照说明书中的Protocol进行RNA的提取。*后，待RNA沉淀物中的乙醇蒸发后，在每个RNA样品中加入25uL的水，整个过程都在冰上操作。

3.取1uL未稀释的RNA样本在NanoDrop上进行检测，样品的浓度和纯度将在结果中直接呈现，用无尘试纸擦拭上下基座，便可进行下一个样品的检测了。重复以上操作，直至所有的RNA样本都检测完毕。

4.取50-100ng RNA在Agilent 2100生物分析仪上进行分析，用毛细管电泳的方法对28S和18S rRNA进行量化分析，得到RIN值（RNA integrity number）。RNA表明RNA的降解水平，RIN值在1（差）至10（*好）之间，一般认为RIN的*低可用的极限是4-5。

5．用NanoDrop检测RNA样本得到的参数和浓度可以通过Excel表导出，用于后续的反转录和Real-time PCR实验。

 
反转录

6．将合适量的RNA加入到每一个反转录的体系中，一般认为：每50uL反应体系加入1ug RNA。对于大多数Real-time PCR实验，*低的反转录起始RNA样本可以低至50ng。

7.或者可以将RNA的浓度进行稀释，将每个RNA样品的浓度调齐。比如都稀释为1.2ug/uL。

8.加入1.2ug的RNA样品，加水将总体积补齐到10uL,提取的RNA中可能存在基因组DNA的污染，可先用DNase I去除：用RNase-free的水配制30ul DNase I反应体系，其中含有2mM MgCl2， 37℃反应10min去除DNA，90℃反应5min使DNase失活。

9.取25ul的反应体系（里面含有1ug RNA），根据SuperScript II（Invitrogen）的Protocol配置终体积为50 ul的反应体系。我们一般用random引物引导反转录。cDNA产物分离、纯化,存储于-20℃或-80℃冰箱中待用。

Real-time PCR

10.cDNA只要保存恰当可以非常稳定，并几乎可供无限次的PCR反应。

11.反转录得到的cDNA可按1:50或1:100进行稀释再使用。配置25ul的Real-time PCR反应体系，只需加入5ul稀释好的cDNA，再加入Real-time PCR试剂（这里推荐的是ABI公司的SYBR Green试剂盒）和目标基因的特异引物，*后用水补齐到25ul。

12. Real-time PCR推荐在荧光定量PCR仪上运行40个循环，如果使用的是SYBR Green染料，建议在40个循环之后再进行一次热变性的反应，检测熔融温度，如果有非特异的产物，则会被检测到杂峰。如果使用的是TaqMan的探针，则无需进行这一步。在实验设计上，一般一个样本需设定3-4个重复，设定一个没有样本的空白对照及一个没有DNase的负对照，来确定是否有基因组DNA污染。

数据分析

13.在终点法定量Real-time PCR中，CT值（到达阈值经过的循环数）非常重要。平均CT值是通过2-3个重复进行计算的，这里演示的是2次重复得到的结果。

14.数据结果在图表上显而易见，经过统计学的分析，用T-Test结果来判断这两组样本（即肝硬化样本和正常样本）间内参基因表达是否存在差异。通过计算两组间的平均表达量的倍性变化，如果理论上相等，说明该内参基因在本次实验条件中是一个合适的内参基因。

总RNA分别从33个人类肝组织中分离得到，这33个样本中包括18个肝硬化和15个正常的样本，从每个样品中取1ul RNA用NanoDrop进行定量。再分别反转录成cDNA；这33个样本的cDNA都用1ug的RNA反转录而来。用U6特异的引物，通过Real-time PCR技术检测U6 RNA的表达情况。通过T-Test计算（P=0.571）发现，U6 RNA的表达在肝硬化样本和正常样本组中都没有明显的变化。
 
15.如果不能确定一个内参基因是否可用，可选择若干个不同的内参基因进行检测和比较，来确定哪个基因是*合适的。在这里，我们选择了18S rRNA或U6 RNA。所用的引物如下：

18S rRNA 
  5’ GTAACCCGTTGAACCCCATT 3’  (forward) 
  5’ CCATCCAATCGGTAGTAGCG 3’  (reverse)
 
  U6 RNA 
  5’ CTCGCTTCGGCAGCACA 3’  (forward)
  5’ AACGCTTCACGAATTTGCGT 3’  (reverse)

16.如果内参基因没有改变，那么便可以用这个内参基因作为参照，按10-12步对目标基因进行定量；如果内参基因发生改变，则重新选择一个新的内参基因，重复10-14步。

结果

U6 RNA表达的水平在肝硬化和正常样本中平均表达量分别为2.94 X 10-5和2.78 X 10-5，倍性变化为1.058，P=0.571。U6 RNA的表达在肝硬化样本和正常样本组中都没有明显的变化，所以U6 RNA可作为本次实验的内参基因。

结论

反转录前，每个反应中需要加入相同量的RNA，以保证定量Real-time PCR的起始cDNA是均一化的。这样才能保证Real-time PCR检测出的变化是RNA实际表达水平的变化，而非是加入的起始cDNA不同而产生的变化。只需1ul的样本，用NanoDrop便能为定量Real-time PCR提供非常理想的均一化检测。用上述模板均一化的方法能帮助我们确定一个合适的内参基因。使用RNA样本均一化的方法和选择合适的内参基因，会让我们对得到的RNA表达水平变化更有信心。