NanoDrop超微量紫外可见光分光光度计的应用（二）

根据MIQE指南对qPCR和RT-qPCR进行核酸的质控

简介

定量 PCR 已经成为分子生物学和临床诊断的基本技术。以前，相关报告很少或没有实现标准化，因此实验经常无法重复。此外，许多技术所依赖的假设，特别是与内参基因稳定性和扩增效率相关的假设，实际上通常是无效的。为了使实验得到更好地设计和恰当地验证并使实验报告包含足够的实验重复信息，关于实时定量 PCR 实验发表需要满足的*低要求实验信息量 (即MIQE指南) 得到了提议。本应用说明详述了核酸质量评估相关的 MIQE 指南，尤其是使用 Thermo Scientific NanoDrop 紫外可见分光光度计所做的核酸定量和纯度评估。

MIQE 指南

MIQE 指南与用于芯片实验的 MIAME 指南大体相同。指南的基本原则是提供全面的方法以评估方案的有效性、结果是否正确解析以及方法的重现性。指南涵盖 qPCR 实验的各个方面，从实验设计到数据分析，但是指南主体与实验方案本身相关。

指南规定对提取后的核酸进行定量是“必选操作”，使用分光光度计评估纯度是“可选操作”。本文通过阐释 qPCR 或 RT-qPCR 前不进行核酸定量的若干潜在风险介绍了这些要求。而且，在此我们指出了纯度评估的重要性；特别是如何通过分光光度法实现污染物检测。

质控

对任何实验而言，进行准确快捷的质控非常重要，未进行样品质控将可能导致数据差错，得出错误结论。由于 qPCR等分子生物学技术沿用较小体积样品，因此这些样品的质量至关重要。从有限的细胞里提取出的样品非常珍贵，如何利用有限的珍贵样品，得到质控信息，至关重要。NanoDrop 分光光度计的微量功能使研究者能够快速简便地进行核酸和蛋白样品的质控检验。

NanoDrop 分光光度计

NanoDrop 分光光度计采用革命性的样品平台技术，通过两条光纤间的表面张力拉伸 1 uL 样品，测量后，使用普通实验室无尘试纸即可简便快捷地从检测表面清除样品，进行下一次检测。

NanoDrop™ 2000/2000c 分光光度计采用可自动根据浓度调整的多光程（1.0 mm、0.2 mm、0.1 mm 和 0.05 mm）来测量1uL 样品，这样的宽动态范围，能够测量 2 - 15,000 ng/uL 的 dsDNA。

与此相反，传统分光光度计采用标准的 10 mm 石英比色皿测量样品，检测上限为 50 ng/uL，*小样品体积为 1 mL。此外，使用比色皿，如清洗不当，可能导致与前次样品交叉污染。

NanoDrop的样品测量速度非常快。NanoDrop 2000c 的每样品检测时间不足 5 秒，在需要更高通量的情况下，NanoDrop 8000 *多可同时测量 8 个样品，时间仅为 20 秒。软件可显示对每个样品计算出的 DNA 浓度、核酸纯度比和光谱图的全部信息。

为何定量如此重要？

使用标准曲线进行绝对定量时，样品必须在标准曲线范围内。如图 1 所示，标准曲线为线性，但是这一趋势不是可以无限延伸的。一旦模板浓度超过 PCR 反应的限值，扩增效率将会降低，定量的线性下降。而模板浓度过低时，背景污染物可能被误认为是扩增信号，信噪比不足。同时，将标准曲线外推至更大范围也是具有风险的，所以，在进行qPCR 前*好确认样品在合适的浓度范围内。

图 1：通过标准点或添加额外的标准点将标准曲线外推至范围以外是十分危险的，因为标准曲线是否仍呈线性尚不明确。在标准曲线外推区域定量未知样品是基于曲线在该点仍呈线性这一未经证明且具有风险的假设。
 
对于相对定量，如通过 RT-qPCR 进行基因表达，较少的模板量会增大误差。如使用适当模板量进行分析，诸如SNP 基因分型等方法亦可生成更为可靠的定性数据。如图 2 所示，未知样品的信号强度应与标准样品类似。模板量过少将使等位基因表达量不可靠甚至无法使用。

图 2：使用适当模板量（左图）和次优数模板量（右图）进行 SNP 基因分型的示例。当使用适当模板量时，未知样品的等位基因信号非常清晰，而模板量少时，等位基因信号会不可靠或无法使用。

纯度为何如此重要？

提取程序中残留的化学污染物将大幅影响下游分析，而很多污染物可采用 NanoDrop 分光光度计检测出来。图 3 显示了纯化的 DNA 样品 (A)，以及被胍 (B) 和苯酚 (C) 污染的同种样品。通过初步检测，两份污染样品均呈现核酸的特异性光谱特征，实际上苯酚污染样品的 260/280 比率多为正常。

图  3 ：无污染的纯化DNA ( A )，以及被胍( B )和苯酚( C )污染的同种DNA样品的光谱图。注意在有污染的样本中，其光谱图中波谷和波峰会发生变化，一般分别出现在230 nm 和 260 nm 处。
 
尽管大致光谱图无法诊断出问题，但是可能有助于鉴别问题是否存在并缩小问题来源的范围。许多污染物吸收发生在 230 nm 或更短的波长附近；有些污染物会给下游应用带来问题。除检测 260/280 比率和光谱的大致形状外，我们还推荐进行下列操作：

• 检查 260/230 比率 – 比率偏小表明样品中有污染物，而该污染物在 230 nm 或更短波长处存在吸收。
• 检查光谱中波谷处的波长 – 应该位于 230 nm 处。在短波处有吸收的污染物一般会使得波谷右移。
• 检查光谱中波峰处的波长 – DNA 和 RNA 应在 260nm处。在长波处有吸收的污染物一般会使得波峰位置右移。

有些污染物具有特征谱图，如苯酚。但是很多污染物的特征谱图相似：吸光度发生在 230 nm 或更短波长处。230 nm处的吸光度可能表明样品或提取过程出现问题，因此全面考虑这两方面十分重要。例如：较高的 A230 值（较小的A260/A230 比率）可能由如下原因导致：

• 多糖残留（通常出现在植物中）。
• 核酸提取中残留苯酚
• 残留胍（通常用于基于色谱柱的试剂盒）
• 用于核酸沉淀的糖原残留