NanoDrop超微量紫外可见光分光光度计的应用（三）

如何避免植物样本核酸提取时多糖的残留？

前言

用分光光度计检测核酸的方法已经非常普遍了，包括对DNA和RNA进行定量，甚至评估它们的纯度。检测的方法是，检测260nm的吸收值，再换算成核酸的浓度。其他波长的吸收值，特别是280nm和230nm，可以通过与它们的比值来判断样本的纯度。因为蛋白的*高吸收峰为280nm，所以A260/A280可以评估蛋白在核酸样本中污染的情况：如果A260/A280小于1.6通常认为这个样本的纯度很差，只有当A260/A280大于1.8则认为这个样本的纯度还不错。同样的，因为有很多多糖的吸收峰在230nm，所以A260/A230常用于判断多糖污染的情况：A260/A230 小于或等于1.6通常认为这个样本的纯度很差, 只有当A260/A230大于1.9则认为这个样本中多糖的污染很少。

因为植物组织中多糖含量相对更高，所以260/230的比值对于植物分子生物实验来说尤为重要。除了细胞壁和细胞中的糖或淀粉，植物细胞还有其他广泛的多糖来源（往往这些多糖具有物种特异性）。为了去除这些多糖，很多实验室根据不同的物种自行研究出一些物种特异的方法。一般来说，植物的核酸提取**步都是组织均浆，可能在缓冲液中进行，也有可能在液氮中研磨，再加入缓冲液。提取的缓冲液在整个方法中非常关键，缓冲液中的成分根据不同的物种而有所不同。缓冲液中除了NaCl还可以加入乙醇来防止多糖的沉淀，在后续的离心中，多糖会溶于上清中，而核酸则会被沉淀下来。因此这样得到的核酸，多糖的污染会比较小。

在本次研究中，将会证明提取缓冲液中的盐浓度对核酸中多糖的污染有很大影响。用NanoDrop 2000进行A260/A230的检测，可以帮助我们判断多糖污染物与植物物种特异性和提取缓冲液中的盐含量的关系。只需1-2ul的样本，用NanoDrop 2000便可很方便的检测样本浓度和纯度。

实验步骤

这里使用的提取方法是根据之前发表的方法进行改进的，包括体积按比例缩小，DNA和RNA的提取，同时对DNA和RNA进行检测。对于提取纯净的DNA来说，*后用RNase处理是必不可少的; 在提取RNA时，在步骤7中可加入0.25体积的10 M LiCl来代替异丙醇。

马铃薯( Solanum tuberosum cv. Russett)来源的样本一般认为含多糖是*高的，而黄瓜( Cucumis sativus)来源的样本则认为是*低的。核酸提取的方法如下：

1. 植物组织（95-105mg）放入1.5ml的离心管中，并放入液氮中冷冻。
2. 组织用研磨仪研磨成粉末，注意避免让样本融化。
3. 将提取缓冲液（2% SDS, 1% PVP-40, NaCl*, 25 mM EDTA, 0.2 M Tris pH 8.0, 2% β-硫基乙醇）提前在60℃预热，加500ul到样本管中，充分混匀。
4. 加入氯仿:IAA（24:1,500ul）的混合液，用*大速度混匀30秒。
5. 用13,000 X g离心样本5分钟，将上清转移到一个新的1.5ml离心管中，重复4-5步。
6. 用等体积的预冷异丙醇来沉淀核酸，并在-20℃过夜。
7. 用13,000 X g离心样本15分钟，用1ml 70%乙醇洗涤核酸沉淀;
8. 核酸沉淀干燥,并重悬于50ul dH2O中。
9. 用NanoDrop 2000检测核酸的浓度和纯度。
*低盐缓冲液 = 0.5 M NaCl; 高盐缓冲液= 1.5 M NaCl。

结果

我们做了四组实验，分别为：马铃薯样本用高/低盐缓冲液，黄瓜用高/低盐缓冲液，每组实验我们做了3个重复。虽然这两种方法提取的核酸在核酸浓度上没有很大的差异，但马铃薯提取的核酸A260/A230比值在两种方法中有明显的差异（图1）。通过对吸收光谱的扫描来确定这个结果：虽然在260nm处核酸的吸收值非常均一，而230nm处的*低峰大概右移到了240nm处（图2），并且230nm处的吸收值有所增强。

图1：马铃薯和黄瓜核酸提取的A260/A230比值。这两个物种分别用高盐缓冲液(1.5 M NaCl)和低盐缓冲液(0.5 M NaCl)提取。每组有3个重复，误差线为标准差。

图2：马铃薯核酸样本的吸收光图谱，分别用高盐缓冲液（红色）和低盐缓冲液（蓝色）

结论

在植物分子生物实验中，多糖存在于植物DNA提取物中是个非常普遍的现象。但是各种数据表明，在提取缓冲液中增加盐含量可以避免多糖污染。在黄瓜核酸提取时，缓冲液中盐浓度的变化对A260/A230的比值影响不大，这个实验表明，当植物组织中多糖足够低时，高或低盐缓冲液都能有效地去除核酸中的多糖。但是像马铃薯等含多糖量高的样本进行核酸提取时，为了避免多糖残留在核酸样本中，提高提取缓冲液中的盐含量是必需的。

将核酸样本稀释10倍，再加入比色杯中，用分光光度计进行检测，这样繁琐的工作令人生厌。用NanoDrop进行核酸定量的一个好处就是，仪器会根据样本的浓度自行进行调整光程。所以NanoDrop2000浓度的检测范围是比色杯分光光度计的200倍。在本次研究中，如果用比色杯分光光度计来检测样本浓度的话，则要对样本进行稀释。

虽然使用NanoDrop自动计算的比值来判断样本纯度是非常方便，但是观察吸收光图谱也是非常重要的。因为除了多糖外，其他的污染物，如苯酚或胍盐也是可以被检测到的。非常宽的动态范围和超微量的上样量，再加上自动计算纯度和全光谱扫描的数据，NanoDrop 2000是分析提取的核酸样本*理想的选择。