如何优化你的RNAi

生物通报道：RNA干扰（RNAi）可以帮助人们特异性关闭基因的表达，是生物学领域的常用技术。本文介绍了一些实用工具和小窍门，希望能帮你优化实验条件，使RNAi更加完美。

新转运工具

为了能够简单有效的转运干扰性RNA（如siRNA、shRNA、miRNA和ncRNA），各大公司纷纷推出了新的分子工具。

siRNA

举例来说，Polyplus Transfection公司的INTERFERin®-HTS平台专为高通量的siRNA转染而设计，支持自动化的液体处理系统。在高通量研究中，“siRNA与转染试剂形成的转染复合体，往往需要稳定存在几个小时，”Polyplus的CEO Mark Bloomfield说。

为此，Polyplus提供了两款改良型siRNA用于活体转染。其中STICKYSIRNA™可以增加siRNA-转运试剂（in vivo-jetPEI®）复合体的稳定性。而SIRNAPLUS™则不需要转运试剂，其转运载体就整合在siRNA分子上。

IDT（Integrated DNA Technologies）公司也推出了siRNA新产品，即由pre-designed siRNA组成的Dicector文库。这一新产品是DsiRNAs（Dicer-substrate siRNAs）产品线的新成员。Dicector DsiRNAs的设计采用改良后的算法，可以靶标所有的人类、小鼠和大鼠基因。shRNA

siRNA一般进行瞬时转染，而shRNA往往被结合在病毒或细菌载体上，实现稳定表达。不过，由于shRNA随机整合到宿主细胞的基因组中，其表达水平并不稳定。

为了解决这一问题，Sigma Aldrich公司开发了一个试剂盒，可以将shRNA插入到基因组的特定位置。据Sigma公司的Shawn Shafer介绍，这一靶向整合试剂盒采用锌指核酸酶技术，将shRNA插入到人类基因组的AAVS1位点。这一技术将shRNA定位在一个地方，使影响shRNA表达水平的一个重要变量固定下来。

Thermo公司致力于寻找促进shRNA表达的最佳启动子。“启动子性能不强会导致knockdown效果不佳，而让人误以为shRNA没有功能或者转导效率太低。实际上可能只是shRNA的表达水平不够，” Thermo公司的Louise Baskin说。

Thermo公司提供的SMARTchoice shRNA平台整合了GFP，让用户能够在同一种细胞中比较多个启动子的性能。最佳启动子能使系统产生最强的GFP信号。

反义RNA

IDT也为靶标细胞核非编码RNA（ncRNA）提供了工具。对于ncRNA来说，siRNA的knockdown效果往往并不理想，而反义寡核苷酸ASO更能发挥作用。据介绍，这可能是因为siRNA主要在细胞质发挥作用，而ASO更适合作用于细胞核。

与siRNA相比，ASO不仅能够激发RNase H的活性，脱靶效应也更低。该技术唯一的问题在于，目前还没有足够成熟的设计软件。

近来，长非编码RNA（lncRNA）一直是研究的热点，ASO技术很适合对其功能进行研究。QIAGEN公司的Eric Lader指出，在用RT-qPCR对这类实验进行结果分析时，需要更多的生物信息学支持。因为与蛋白编码基因数据库相比，lncRNA序列数据库还不那么成熟。

如何让knockdown更加可靠

无疑，RNAi需要在健康的细胞中进行。Bloomfield建议大家使用传代不超过20次的细胞。此外，实验所用的细胞类型，也会影响RNAi的转运工具。“没有一个对所有细胞系都适用的最佳转运方案，因此我们在尝试新细胞类型时要谨慎选择RNAi工具，”Baskin说。另外，不论何时都应考虑到RNA转运对细胞的毒性，在毒性与转运效率之间寻求平衡。

在用抑制性RNA进行knockdown之后，一般要通过mRNA和蛋白的水平，来检测RNAi的效率。这时，选择合理的对照非常重要，阴性对照一般采用非靶向性的RNA，而阳性对照往往靶标的是看家基因（如GAPDH、PPIB或 HPRT）。

实际上，RT-qPCR对结果的影响很大。“适当的阳性/阴性对照，合理的RT-qPCR分析，都决定着knockdown效果的重现性，”Lader说。“80% knockdown与50% knockdown之间的差异，对于实时定量PCR来说，只是一次循环中的一点变化。”

在判定knockdown效果时，表达时机也很重要。“可以根据蛋白和目标mRNA的半衰期，在转染后24到96小时之间，确定进行结果分析的最佳时间段，这样才能更好的解读基因沉默的效果，”Bloomfield说。

Baskin指出，RNAi分析中有一个常见的误区，就是希望目标的knocked down程度与阳性对照（看家基因）相同。“不是所有的目标基因都以同样的方式表达，也不是所有的RNAi试剂都与阳性对照一样强力，”他说。

“越来越多的数据显示，在不同细胞类型中使用同样的RNAi试剂，会产生不同的基因沉默效果和脱靶效应，”Baskin说。因此专家建议，为了保证RNAi的效果，每个细胞系都应该进行条件优化。事实上，同一个细胞系中的转染效率可能也不稳定，最好的办法是，每一次RNAi都使用阴性和阳性对照。

 

（Caitlin Smith撰写）