如何优化你的RNAi

【字体: 时间:2013年12月12日 来源:生物通

编辑推荐:

  RNA干扰(RNAi)可以帮助人们特异性关闭基因的表达,是生物学领域的常用技术。本文介绍了一些实用工具和小窍门,希望能帮你优化实验条件,使RNAi更加完美。

生物通报道:RNA干扰(RNAi)可以帮助人们特异性关闭基因的表达,是生物学领域的常用技术。本文介绍了一些实用工具和小窍门,希望能帮你优化实验条件,使RNAi更加完美。

新转运工具

为了能够简单有效的转运干扰性RNA(如siRNAshRNAmiRNAncRNA),各大公司纷纷推出了新的分子工具。

siRNA

举例来说,Polyplus Transfection公司的INTERFERin®-HTS平台专为高通量的siRNA转染而设计,支持自动化的液体处理系统。在高通量研究中,“siRNA与转染试剂形成的转染复合体,往往需要稳定存在几个小时,”PolyplusCEO Mark Bloomfield说。

为此,Polyplus提供了两款改良型siRNA用于活体转染。其中STICKYSIRNA™可以增加siRNA-转运试剂(in vivo-jetPEI®)复合体的稳定性。而SIRNAPLUS™则不需要转运试剂,其转运载体就整合在siRNA分子上。

IDTIntegrated DNA Technologies)公司也推出了siRNA新产品,即由pre-designed siRNA组成的Dicector文库。这一新产品是DsiRNAsDicer-substrate siRNAs)产品线的新成员。Dicector DsiRNAs的设计采用改良后的算法,可以靶标所有的人类、小鼠和大鼠基因。shRNA

siRNA一般进行瞬时转染,而shRNA往往被结合在病毒或细菌载体上,实现稳定表达。不过,由于shRNA随机整合到宿主细胞的基因组中,其表达水平并不稳定。

为了解决这一问题,Sigma Aldrich公司开发了一个试剂盒,可以将shRNA插入到基因组的特定位置。据Sigma公司的Shawn Shafer介绍,这一靶向整合试剂盒采用锌指核酸酶技术,将shRNA插入到人类基因组的AAVS1位点。这一技术将shRNA定位在一个地方,使影响shRNA表达水平的一个重要变量固定下来。

Thermo公司致力于寻找促进shRNA表达的最佳启动子。“启动子性能不强会导致knockdown效果不佳,而让人误以为shRNA没有功能或者转导效率太低。实际上可能只是shRNA的表达水平不够,” Thermo公司的Louise Baskin说。

Thermo公司提供的SMARTchoice shRNA平台整合了GFP,让用户能够在同一种细胞中比较多个启动子的性能。最佳启动子能使系统产生最强的GFP信号。

反义RNA

IDT也为靶标细胞核非编码RNAncRNA)提供了工具。对于ncRNA来说,siRNAknockdown效果往往并不理想,而反义寡核苷酸ASO更能发挥作用。据介绍,这可能是因为siRNA主要在细胞质发挥作用,而ASO更适合作用于细胞核。

siRNA相比,ASO不仅能够激发RNase H的活性,脱靶效应也更低。该技术唯一的问题在于,目前还没有足够成熟的设计软件。

近来,长非编码RNAlncRNA)一直是研究的热点,ASO技术很适合对其功能进行研究。QIAGEN公司的Eric Lader指出,在用RT-qPCR对这类实验进行结果分析时,需要更多的生物信息学支持。因为与蛋白编码基因数据库相比,lncRNA序列数据库还不那么成熟。

如何让knockdown更加可靠

无疑,RNAi需要在健康的细胞中进行。Bloomfield建议大家使用传代不超过20次的细胞。此外,实验所用的细胞类型,也会影响RNAi的转运工具。“没有一个对所有细胞系都适用的最佳转运方案,因此我们在尝试新细胞类型时要谨慎选择RNAi工具,”Baskin说。另外,不论何时都应考虑到RNA转运对细胞的毒性,在毒性与转运效率之间寻求平衡。

在用抑制性RNA进行knockdown之后,一般要通过mRNA和蛋白的水平,来检测RNAi的效率。这时,选择合理的对照非常重要,阴性对照一般采用非靶向性的RNA,而阳性对照往往靶标的是看家基因(如GAPDHPPIB HPRT)。

实际上,RT-qPCR对结果的影响很大。“适当的阳性/阴性对照,合理的RT-qPCR分析,都决定着knockdown效果的重现性,”Lader说。“80% knockdown50% knockdown之间的差异,对于实时定量PCR来说,只是一次循环中的一点变化。”

在判定knockdown效果时,表达时机也很重要。“可以根据蛋白和目标mRNA的半衰期,在转染后2496小时之间,确定进行结果分析的最佳时间段,这样才能更好的解读基因沉默的效果,”Bloomfield说。

Baskin指出,RNAi分析中有一个常见的误区,就是希望目标的knocked down程度与阳性对照(看家基因)相同。“不是所有的目标基因都以同样的方式表达,也不是所有的RNAi试剂都与阳性对照一样强力,”他说。

“越来越多的数据显示,在不同细胞类型中使用同样的RNAi试剂,会产生不同的基因沉默效果和脱靶效应,”Baskin说。因此专家建议,为了保证RNAi的效果,每个细胞系都应该进行条件优化。事实上,同一个细胞系中的转染效率可能也不稳定,最好的办法是,每一次RNAi都使用阴性和阳性对照。

 

Caitlin Smith撰写)

我来说两句
0  条评论    0 人次参与
登录 注册发布
最新评论刷新
查看更多评论 > >

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器龙虎榜

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号