dPCR vs. qPCR 我该如何选择？[心得点评]

数字PCR（dPCR）是PCR领域的新浪潮。它的与众不同之处在于样品分液。通过微流体芯片、通道或液滴实现分液，而每个都作为单独的PCR反应，带来了出色的灵敏度。同时，也无需建立标准曲线。然而，我们究竟应不应该追赶这个新浪潮？这在很大程度上取决于你的应用和所需的灵敏度水平。何时应该选择dPCR，让我们听听专家的意见。

当你需要检测稀有事件时

美国Sangamo BioSciences公司是锌指核酸酶研究领域的先锋。它试图改造DNA结合的锌指核酸酶，从而定制基因表达，实现基因治疗。Sangamo目前正利用数字PCR平台（QX100系统，Bio-Rad），开发HIV的功能疗法。

Sangamo的资深科学家Gary Lee表示：“对于定量PCR能够给出精确答案的传统应用，那就没必要转向数字PCR。由于我们面对的是低拷贝事件，有时利用qPCR无法获得答案。数字PCR对我们跟踪患者的治疗进展很关键。”

HIV+受试者的现有数据表明，HIV DNA整合到宿主细胞基因组中是一个稀有事件，外周血中每1,000-100,000个CD4+ T细胞仅有一个。这种低水平的HIV DNA可维持低水平的病毒复制，特别是在淋巴组织中。因此，Sangamo研究的一个主要挑战是测定受试者的HIV DNA水平，从而评估新疗法的效果。数字PCR技术能实现目标DNA和RNA分子的绝对定量，带来比qPCR更高的灵敏度、重复性和精确度。

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当你需要绝对定量时

qPCR测定样品相对于连续稀释的标准曲线的拷贝数。测定是相对而言，并非样品本身真正的拷贝数。它在很大程度上依赖于准确的标准曲线。当然，你也要花相当多的时间去建立标准曲线。例如，如果你想要研究一段新颖的重组DNA序列，那么你首先要得到遗传序列，将它克隆到质粒上，获得质粒储液，将质粒线性化，然后检测引物探针。数字PCR则不需要标准品，从而能节约时间。

当你需要检测细微变异时

数字PCR特别适合某些应用，如检测稀有等位基因、验证新一代测序实验，以及确定细微的拷贝数变异。例如，人类基因组中的某些基因存在一定量的重复或突变，而研究人员希望了解特定群体中这种突变对基因表达或疾病风险的影响。为了开展这一研究，你必须精确地测定基因组序列变异的拷贝数。实时定量PCR可能需要运行多个重复，才能检测这种细微变异。

有时qPCR刚好符合要求

Sangamo在同时采用qPCR和dPCR，对于大部分应用，qPCR的表现不错。正如Lee所说的，两个系统都能测定样品中的DNA拷贝数。尽管dPCR直接测定绝对拷贝数，而qPCR依赖标准品，但两者不应有差异，除非到了qPCR的检测极限。在正确开展qPCR时，结果也应是重复的。尽管dPCR对于某些应用更加精确和可靠，但无疑每个反应的成本更高，且目前也存在一些高通量限制。

Gary Lee补充道：“dPCR的需求确实是应用依赖的。qPCR应用得如此广泛，您可以得到很多支持，也有很多试剂可以选择。只有当你面对某些限制时，dPCR才能真正让你的研究受益。”（生物通 薄荷）