#微孔板秘笈3#原位微量PicoGreen法定量DNA 浓度[创新技巧]

-BioTek Take3™ 超微量多体积检测板的新应用

生物通联合BioTek在2013年重磅推出#微孔板秘笈#，为您介绍微孔板相关检测产品的应用。3月我们将聚焦超微量检测，介绍核酸定量方法及原理，原位微量BCA蛋白定量法，以及通过原位微量PicoGreen法定量DNA浓度。本文介绍了使用Take3 板进行微量荧光DNA 定量的方法。

Peter Brescia,MSc. and Peter Banks, Ph.D., BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT

介绍

BioTek 公司的Take3™ 超微量多体积检测板是一个非常灵活的应用工具，可以用于全光谱的吸收光读数，广泛覆盖了吸收光检测的各项应用，同时可以灵活控制样品的体积，并在微孔板检测仪上进行相关定量检测。微量未经稀释的DNA，RNA 以及蛋白样品的定量目前主要是通过原始吸收光测定来完成的。通过Take3 模块，用户可以进行16 个体积为2μL样品的吸收光检测，并保证优异的准确性和精确性。对于测序、qPCR 以及蛋白分析等下游工作，需要进行快速微量核酸蛋白样品定量的客户来说，Take3 是个非常好的辅助检测工具。

Take3™ 板同时还可以完成基于比色法的检测分析。微量检测板既可以作为反应容器也可以作为样品检测容器，因此既可以简化流程也可以节省样品。实验证明在Take3 上原位完成检测与传统在其他容器中反应过后加样检测的流程相比，可以明显提高检测准确性。

本文介绍了使用Take3 板进行微量荧光DNA 定量的方法。实验中我们使用Synergy™ 多功能微孔板检测仪进行最终检测，采用Quant-iT PicoGreen 荧光检测试剂进行标记，探讨DNA定量的线性范围和最低检测浓度。

材料和方法

材料
Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA 定量试剂盒, 购于Life Technologies，MolecularProbes Division（Eugene, OR, PN-P7589）。PicoGreen 试剂新鲜配制，使用15μL TE 缓冲液稀释，避光保存，并于2 小时内使用。DNA 检测标准，来源于青鱼卵子所提取的dsDNA (Sigma,PN-A3294)。储存于TE 缓冲液中(Tris-EDTA, pH7.0)。

方法
所有PicoGreen 反应和检测均在Take3 板上完成。操作方法与之前介绍的原位法BCA 蛋白定量相似。图1. 显示了操作流程和Take3 板上的排布方法。简而言之，将2μL 的标准品和未知样品分别加到Take3 板的相应检测点位上。然后在相同位置上分别加入2μL 的PicoGreen 试剂，使两者比例为1:1，然后用枪头轻轻吹打混匀（注意不要产生气泡）。空白样品为2μL 的TE 和2μL 的PicoGreen 试剂加在Take3 板上的光路和滤光片光路上进行检测或者在SynergyHT 上进行检测。所有检测均使用Gen5™ 软件进行操作和数据分析。所有样品均逐孔进行顶部底部检测，重复2-3 次，甲醇拭去样品及残留试剂。

图1：Take3 板图中描述了Lambda dsDNA 标准品以及4 个未知样品的浓度和位置。该图提示6 个标准品，双复孔A-F 成列排布，原位微量分析浓度范围10-1000ng/mL。

仪器设定和数据分析
Synergy™ H4 全功能微孔板检测仪的双光栅和滤光片光路以及SynergyHT 的顶部荧光检测光路用于进行DNA 溶液的定量。光栅光路均选择9nm 带宽，激发波长495nm，发射波长526nm。Z 轴垂直高度设于6mm 可获得最好的信噪比(S/N)。滤光片光路选择激发光485/20nm 滤光片，发射光选择528/20nm 滤光片。所有Synergy 检测仪均采用氙灯光源( 滤光片光路采用高能氙灯)。Gen5 软件使用自动校准灵敏度的功能进行检测信号的采集，设定F2:F3(1000ng/mL) 孔DNA 浓度为最高，对应每点255 次检测，相对荧光信号值为60000。

Take3 板采用白色特氟龙涂层打印膜确定检测微点位置，可以在Synergy 光栅光路进行检测。光栅所产生的检测光束横截面小于微点的横截面。对于滤光片系统而言，荧光背景信号高从而降低了检测性能，无法进行低浓度DNA 的定量，如果采用黑色特氟龙涂层膜，就可以明显降低荧光检测的背景。本文所进行的所有检测均采用黑色特氟龙图层覆盖的检测板。

所有DNA 检测均使用空白矫正。信噪比(S/N) 通过每孔平均荧光信号的标准差扣掉空白值来确定。标准曲线采用线性回归方程。

结果讨论

6 个标准品浓度测定的标准曲线确定了PicoGreen 分析的DNA 定量范围是10-1000ng/mL。图2. 显示了每种检测光路所得到的标准曲线。除光路不同以外，所有检测均采用方差线性回归分析，R2 值均>0.999, n=3. 很明显，从标准曲线的斜率上看，滤光片系统提供了良好的检测灵敏度。

图2. SynergyH4、SynergyHT 的光栅和滤光片光路的最小方差线性回归分析。误差线代表SEM（n=3）

图3 显示了几种光路的标准曲线中每孔DNA 浓度的S/N 值。可以看到光栅检测光路在低浓度DNA（≤ 100ng/mL）检测时S/N 明显增高。这时所产生的低背景效果是由于光栅提供了较细的检测光束。由于滤光片系统具有更好的透光效率，因此在较高浓度DNA（≥ 100ng）时，具有更好的S/N 值。

图3. 每种光路下采用标准曲线分析DNA 浓度时的S/N 值。误差线反映了空白孔和DNA 检测孔的错误程度( 标准差)。

Take3 上的16 个微量检测通道可以同时满足标准曲线和样品的检测。通过在原位进行加样操作及检测，由于孵育时间、温度及不同操作所带来的误差被降低了。按图1. 中显示的Take3 板加样检测顺序，采用SynergyH4 的光栅光路对未知低浓度的DNA 样品（25ng/mL）和高浓度DNA 样品（500ng/mL）进行定量获得很好的准确性。两个DNA 样品定量的准确性分别是＋ 1.6% 和-3.0%。同理，在Synergy 系列微孔板检测仪上均获得相同的检测效果。

结论

Take3 超微量检测板可以用于进行低浓度荧光法DNA 定量。其DNA 定量的最低浓度可以达到ng/mL。这种方法有效的将传统A260 吸收光检测的动态范围提高了3 个数量级。原位操作的方法，将样品、标准品以及PicoGreen 试剂直接加在Take3 检测板上，整个操作简单方便节省样品和检测试剂并提高了检测的准确性。Take3 可以在全部Synergy 产品线上进行微量的样品分析。

欢迎索取《BioTek微孔板相关检测产品应用手册》

参考文献
1. Brescia, P. and Banks, P. Multi-Volume Analysis of Nucleic Acids using the Epoch™ Spectrophotometer System, Winooski, (VT), BioTek Instruments, Inc., Nov, 2009.
2. Brescia, P. and Banks, P. Analytical Performance ofNucleic Acids Micro-Volume Quantifi cation Using the Epoch ™ Spectrophotometer System, Winooski, (VT), BioTek Instruments, Inc., Dec, 2009.
3. Brescia, P. and Banks, P. Analytical Performance ofEpoch ™ Multi-Volume Spectrophotometer System for Protein Quantifi cation, Winooski, (VT), BioTek Instruments, Inc., Jan, 2010.
4. Brescia, P. and Banks, P. In-situ Micro-Volume Bicinchoninic Acid Protein Assay, Winooski, (VT), BioTek Instruments, INC., Feb, 2010.