如何突破测序限制 发现稀有变异[创新技巧]

去年，美国国家心脏、肺和血液研究所的研究人员在对2400个个体的外显子组进行测序和分析之后，发现大部分单核苷酸变异是罕见的，只占样品群体的0.5%以下。这也解释了为什么全基因组关联研究（GWAS）在复杂疾病上通常很难成功。

尽管新一代DNA测序为疾病相关突变的检测和个性化药物的开发带来了巨大希望，但稀有变异的检测能力仍然受到限制，样品制备、测序和分析过程都有可能引入错误。尽管错误率仅有1%，但对于癌症研究人员来说还是没办法接受，这让人难以检测通常在疾病中扮演重要角色的稀有变异。为此，科学家们正在设法鉴定这些错误，并提高测序的准确性。Janelle Weaver博士在此介绍了一些实验室的应对方案。

降低错误频率

Larry Loeb是华盛顿大学的一名癌症研究人员，他正在尝试更好地捕获稀有变异。由于测序方法的不准确，他的实验室只能查看频率在10%以上的突变。他们希望有一种更准确的方法，能查看并非存在于所有细胞中的变异，而是亚克隆或随机的变异。

去年，Loeb和他的研究小组在《PNAS》上介绍了一种方法，名为双重测序法（Duplex Sequencing）。1 通过给DNA的两条链加上独立的标签并测序，这种方法能够实现理论背景错误率低于1个人为突变/10亿个碱基。因此，它适用于高灵敏度地检测稀有变异，以及精确地测定DNA或RNA的绝对拷贝数。

在双重测序法中，双链DNA片段的两条链被加上随机但互补的双链核苷酸序列。双链标签序列可掺入到标准的Illumina测序接头中，方法是首先在随机的单链核苷酸序列上引入一个接头链，然后通过DNA聚合酶延伸另一条链，产生互补的双链标签。将加了标签的接头与经过剪切的DNA连接后，这些链经过PCR扩增和末端配对测序。

将两条链所获得的序列进行比较，Loeb及其同事可区分出测序错误和真正的突变。因为两条链是互补的，突变可在两条链的同一位置上发现。相比之下，PCR或测序错误只在一条链上产生突变，从而可判定为技术错误。

Loeb表示：“其他最好的方法是每1000个核苷酸中有一个错误。如果你想了解所有细胞中存在的遗传变异，那就足够了。但是如果你想了解稀有变异，或了解肿瘤内突变的分布，那么错误率还是太高了。”

样品制备也要当心

尽管科学家们都认识到PCR和新一代测序过程中会引入错误，但似乎没人注意DNA提取和样品制备过程中产生的错误。最近一篇发表在《核酸研究》上的文章提出了这一问题。Broad研究院Gad Getz领导的研究小组发现了一种新的人为突变，在样品制备过程中产生。2

根据这项研究，一些样品中包含了提取过程中残留的活性污染物，而在超声剪切过程中，DNA的氧化导致少量等位基因片段发生C>A/G>T的颠换，从而被超高覆盖度的测序检测到。向剪切缓冲液中添加金属螯合剂，可减少这些氧化引起的假象，而后期处理过滤方法也能筛选出测序数据中氧化引起的错误。这些研究结果表明，实验室操作步骤的改变以及信息学工具的使用能帮助研究人员解决这些问题。

加州大学旧金山分校的Nadav Ahituv评价道：“人们意识到任何测序技术都有错误，因此我一点都不意外。可喜的是他们找到了问题的原因，并提出很好的计算工具来减少问题。”Ahituv本人并没有参与这项研究。

除了这些文章所介绍的实验和信息学方法，也有其他方法能改善测序准确性。据卡罗林斯卡医学院癌症系统生物学的专家Jussi Taipale介绍，准确性也受到聚合酶错误率的限制。“如果我们能够开发出错误率更低的聚合酶，如果我们能够对付突变的所有化学来源，那么这无疑更有帮助。”

对临床的影响

研究稀有变异的研究人员可能不需要等待太久，就能使用到其中的一些方法。例如，双重测序法经过修改，可适用于多个测序平台，而包含双链标签序列的接头可取代标准的测序接头，也不会明显改变正常的样品制备流程。

更重要的是，双重测序能够揭示赋予耐药性的稀有变异。阿尔伯特•爱因斯坦医学院的Jan Vijg谈道：“如果我们已经知道肿瘤中的一些细胞带有特定变异，让它们有机会耐受某种特定的药物，那么我们可以尝试另一种药。这可能对临床有直接影响。”此外，单细胞测序的发展也能进一步协助研究人员发现这些突变。

至于双重测序是否适用于各种类型的突变，目前还未有定论。研究人员主要将它应用在小的突变——点突变上。对于较大的变异，如大的缺失、易位或拷贝数变异，目前还不清楚它是否有用。

当然，双重测序法也不会取代标准方法。Loeb认为，这种方法对于外显子组测序而言太过昂贵。他谈道：“对于异质细胞混合物的测序，或者当你需要超高准确性时，这真的很棒。因此，从某种意义上说，它可能限制在癌症研究、病毒群体以及古老DNA的法医研究等。”

Nadav Ahituv也同意他的观点，认为各种测序方法会平行使用。“这两篇文章的最重要意义在于，如果我们想要利用新一代测序技术寻找稀有变异，那么我们一定要非常小心。”

（作者：Janelle Weaver/生物通编译）

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参考文献：

1. Schmitt, M.W., S.R. Kennedy, J.J. Salk, E.J. Fox, J.B. Hiatt, and L.A. Loeb. 2012. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proc Natl Acad Sci U S A 109(36):14508-13. doi: 10.1073/pnas.1208715109.

2. Costello, M., T.J. Pugh, T.J. Fennell, C. Stewart, L. Lichtenstein, J.C. Meldrim, J.L. Fostel, D.C. Friedrich, D. Perrin, D. Dionne, S. Kim, S.B. Gabriel, E.S. Lander, S. Fisher, and G. Getz. 2013. Discovery and characterization of artifactual mutations in deep coverage targeted capture sequencing data due to oxidative DNA damage during sample preparation. Nucleic Acids Res. doi: 10.1093/nar/gks1443.