#微孔板秘笈2#核酸定量方法及原理

生物通联合BioTek在2013年重磅推出#微孔板秘笈#，为您介绍微孔板相关检测产品的应用。3月我们将聚焦超微量检测，介绍核酸定量方法及原理，原位微量BCA蛋白定量法，以及通过原位微量PicoGreen法定量DNA浓度。核酸定量，该采取哪种方法，注意哪些问题？请看本文。

编者按：生物通联合BioTek在2013年重磅推出#微孔板秘笈#，为您介绍微孔板相关检测产品的应用。3月我们将聚焦超微量检测，介绍核酸定量方法及原理，原位微量BCA蛋白定量法，以及通过原位微量PicoGreen法定量DNA浓度。

核酸是一切生物都含有的存在于细胞核的重要成分, 是生命现象中不可缺少的生物大分子, 也是生物遗传信息的载体，它控制着蛋白质的合成和有机体细胞的机能, 在生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异等生命活动中占有极其重要的地位. 随着分子生物学的广泛应用, 核酸定量已经成为一种常规化的实验手段。

广泛用于测定制备物中核酸含量的方法有两类。如果样品较纯（即蛋白质、酚、琼脂糖以及其他核酸等杂质含量较低时），可通过分光光度法测定其吸收紫外线的量，既简便又准确。若样品中DNA 或RNA 含量较低或含有较多杂质，则可以通过溴化乙锭或Hoechst 33258 等荧光染料所发出的荧光估测核酸的含量。

DNA 或RNA 的分光光度法测定

核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。每种核酸的分子构成不一， 因此其换算系数不同。定量不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光值分别相当于50μg / mL 的dsDNA，37μg / mL 的ssDNA， 40μg/mL 的RNA，30μg/mL 的寡核苷酸。测试后的吸光值经过上述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，而后测试空白液和样品液。

然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器， 表现出的吸光值漂移越大。事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，对应吸光值在一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。另外， 还需考虑核酸本身理化性质和溶解核酸缓冲液的pH 值、离子浓度等。在测试时，离子浓度太高也会导致读数漂移，因此建议使用pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液（如TE）可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低， 甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。

除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度，如A260 / A280 的比值， 用于评估样品的纯度，因为蛋白的吸收峰是280 nm。

纯净的样品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。假如比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、多肽、酚盐离子或硫氰酸盐等，较纯净的核酸A260/A230 的比值大于2.0 。A320 检测溶液的颗粒度、混浊度和其他干扰因子。纯样品的A320 一般是 0。水饱和酚在270nm 处有特征吸收，无酚的核酸制品A260/A270 比值约为1：2。

各波长具体含义及相关问题

1．A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1 至1.0。假如不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；假如吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。

朗伯－比尔定律：
A 吸光值
I0 入射光强度
I 投射光强度
c 吸光物质的摩尔浓度（mol/L）
d 光通过的液层厚度（cm）
ε 摩尔吸光系数（Lmol-1cm-1）

2．A280nm 是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 的260/A280 比值为1.8，纯RNA 为2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族）或酚类物质的污染，需要纯化样品。

3．A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估：纯DNA 和 RNA 的A260/A230 比值为2.5。若比值小于2.0 表明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。

4．A320nm 或A340nm 为检测溶液样品的浊度，该值应该接近0.0。假如不是，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。

5．核酸的吸光值受pH 值和缓冲液离子浓度影响。只有在一定的pH 值和低离子浓度的条件下（如10 mM Tris-HCl pH 8.0），才能得到精确的检测结果。

水的pH 值不稳定，可能导致检测误差。一些缓冲液在紫外范围内存在自身吸收，为了确保准确测量，请使用与悬浮或洗脱样品时相同的缓冲液。

6．在DNA 样品的测定中，一些平行测定的样品会表现出测定浓度的变化，其可能原因为：① DNA 样品的A260 吸光度值是否>0.1。（请注重，这个值跟仪器无关，核酸的吸光度必需大于0.1，其值才有效和可靠，因为样品中的杂质和颗粒这些不纯物的干扰通常会对光有一定吸收，其值<0.1）；②待测样品是否经过了充分的混匀，这样才能保证测定值的均一；③待测样品中有相当含量的杂质。A260/A280 和A260/A230 是DNA 纯度的指示值，纯度好的DNA，在pH7-8.5 下其比值应该在1.8 或2.5，A230 是多肽、芳香基团、苯酚和一些碳氢化合物的吸光度，A280 是蛋白质的吸光度。

7．A230 产生负值主要是由于在很低DNA 浓度的溶液中的一些其他成分的干扰所导致的。在下一个测定中，需要降低样品的稀释度，A230 的负值会被校正。同时需要注重的是A260 的读数也必需大于0.1 才能保证可靠的结果。

DNA/RNA 的荧光测定

用荧光测定法分析核酸浓度操作简便而且比分光光度法灵敏，可测定纳克级水平的DNA。由于Hoechst33258 对小分子DNA 的结合能力较弱，这种方法只能用来测定长度超过1kb的DNA 溶液的浓度。测定时，讲浓度已知和未知的DNA 制品与荧光染料保温，把未知样品的吸收值与一系列浓度已知样品的吸收值相比较，通过内推法，可得未知样品的浓度。

Picogreen 染料是一种新型的dsDNA 染料：其检测灵敏度高，可检测到pg 级DNA；检测范围宽，可跨越４个数量级；特异性好，基本不受ssDNA 和RNA 的影响，并且可以耐受一定浓度的盐、尿素、乙醇、氯仿、去垢剂、蛋白等干扰。目前使用Picogreen 染料定量检测DNA 已经广泛用于生物学检测，并被2010 年版《中华人民共和国药典》选为药物残留DNA 定量方法。

有时样品中DNA 含量不足以通过分光光度法测定，有时DNA 严重污染有吸收紫外射线的其他杂质而妨碍准确测定，一个快速的办法是利用溴化乙锭嵌入DNA 分子中后由紫外激发的荧光来估测这种样品中DNA 的含量。由于荧光强度与DNA 总量成正比，可通过比较样品和一系列标准溶液产生的荧光估测DNA 含量。

RiboGreen RNA 定量试剂是一种超灵敏的核酸荧光染料，使用这种染料可以对溶液中的RNA 进行简单快速的定量。常规定量RNA 的方法是在260nm 处检测溶液的光吸收度，但是这种定量方法灵敏度差（4μg/mL RNA），且易受溶液中寡核苷酸、蛋白、盐离子等的影响。使用RiboGreen 荧光染料可以避免上述这些问题。当RiboGreen 荧光染料处于溶液状态时，其几乎没有荧光活性；当RiboGreen 与RNA 结合，其荧光活性将增加1000 倍。RiboGreen-RNA 复合物的荧光激发波长约500nm，发射波长约525nm。使用RiboGreen 荧光染料可以检测到2.5ng/mL 的RNA，这比260nm 吸收法要高出千倍。

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