五篇Science、Nature文章基因组编辑技术

【字体: 时间:2013年03月08日 来源:生物通

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  近期,《科学》(Science)和《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上,接连发表了5篇研究论文,报告了研究人员现在称之为CRISPR–Cas系统的这一细菌序列的应用,它成为了基因组编辑的一个简单通用工具。

  

生物通报道  一种可利用导向RNA分子靶向裂解DNA的细菌酶,一直以来被用作为一种可编程工具,位点特异性修改从细菌、人类细胞到斑马鱼等生物及细胞的基因组。

在1987年的一篇论文中,日本大阪大学的研究人员报告了一项表面上微不足道的研究发现。他们在调查一种编码碱性磷酸酶的细菌基因序列时,发现了邻近的一个不同寻常的DNA片段,这一DNA片段中间是一段短直接重复核苷酸序列,两侧为短特异片段。他们当时指出“这些序列的生物学意义尚不清楚”。在几乎过去快30年后,这一最初看起来不起眼的研究发现,现在为简易操控大量生物体的基因组打开了大门。

近期,《科学》(Science)和《自然生物技术》(Nature Biotechnology)杂志上,接连发表了5篇研究论文,报告了研究人员现在称之为CRISPR–Cas系统的这一细菌序列的应用,它成为了基因组编辑的一个简单通用工具。

随着近几十年来全基因组测序常规化,在很多的细菌和古细菌中发现了包含CRISPR序列的区域和CRISPR相关(Cas)基因。发现这些短独特序列能与病毒或质粒DNA序列相匹配,表明CRISPR–Cas系统能够编码“适应性”免疫系统,提供特异防御对抗入侵者。随后的遗传和生物化学实验证实了这一猜测,表明CRISPR–Cas允许检测和防止移动遗传元件。

尽管一些CRISPR–Cas系统需要多种蛋白才能发挥功能,在许多细菌中发现的II型系统却只需利用一种内切核酸酶Cas9。该酶与导向RNA协同作用定位在PAMs保守序列限定的位点,裂解入侵DNA。为了形成功能性的DNA靶向复合物,Cas9需要两种不同的RNA转录物,crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(transactivating crRNA )。然而,近期的研究表明,这样的双RNA可以重新装配成一种单导向RNA (single-guide RNA,sgRNA),其包含的序列足以编程Cas9,介导靶DNA双链断裂。

新的研究论文表明,RNA导向Cas9可以在多种细胞和生物体中发挥功能,在特异位点裂解完整基因组。这一点使得它具有基因组编辑的潜能。当借助于同源重组或是非同源末端连接,这些标准的细胞修复机制修复双链断裂时,可以此修改修复位点的序列,或插入新的遗传信息。

近期的三项研究证实RNA编程Cas9可以在人类细胞中发挥功能。美国哈佛-麻省理工Broad 研究所、哈佛大学医学院和首尔大学的三个独立研究小组,设计出了来自产脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9酶版本,它能在人类细胞核中维持活性。研究人员还设计出了双RNAs或 sgRNAs,它们包含着与人类靶DNA序列互补的20个核苷酸序列。当研究人员在各种人类细胞系中表达这种“人源化” Cas9和导向RNAs时,他们观察到靶DNA发生了预期的改变,介导了双链断裂及随后的修复。这种基因打靶成功率高达38%,只伴随有低水平的Cas9毒性。这种RNA导向Cas9还可有效触发人类细胞中正常基因组位点的靶向性基因置换。

早先的研究发现,单链RNA断裂有利于同源重组,以及减少脱靶突变。基于此,美国哈佛-麻省理工Broad 研究所和哈佛大学医学院研究人员还对Cas9进行测试。发现突变酶非同源末端连接效率较低,但同源重组触发的基因置换和野生型内切核酸酶一样有效。两个小组还进一步证实了该系统在“多路”靶向中的功能;sgRNA编程Cas9可结合两种不同的基因组序列,其表达可导致不止一个靶位点序列断裂。此外,Broad 研究所的研究人员还证实单独表达原来双tracrRNA–crRNA组合中的两个RNA元件,基因破坏效率能够进一步提高。这一研究发现表明改良sgRNAs或许可使它们更好地模拟双RNA结构。

除了这些在细胞系中获得的研究结果,洛克菲勒大学的研究人员还利用RNA导向的Cas9操纵了完整生物体的基因组。他们证实通过在单细胞中采用不同的几种导向RNA编程Cas9,可在细菌中使用这一系统修改多个位点。此外,麻省总医院的研究人员证实将Cas9编码mRNA和适当的导向RNAs注入到单细胞期胚胎中,在所有测试胚胎中导致了10个位点中的8个发生了高频率(24–59%)的靶向性插入和删除。这些研究结果表明,RNA导向Cas9可能能够用于操纵其他的多细胞生物,包括哺乳动物和植物。该技术另一个最让人感到兴奋的潜在应用是,为生成人类疾病动物模型提供了一种简单的方法。

利用RNA可编程Cas9进行基因组操作,有望广泛应用于合成生物学、直接和多路干扰基因网络,体内外靶向性基因治疗。下一个挑战将是分析和解决可能出现的脱靶效应,提高系统效率和特异性,扩大应用到其他生物体。就这方面而言,比较RNA编程Cas9与现有的基因编辑工具,包括大范围核酸酶、ZFNs和TALENs将具有极重要的意义。除了基因组编辑,这一方法可为利用失活性Cas9导致转录性基因沉默,或工程操作Cas9获得转录激活等新功能提供了可能性。限制性酶和耐热聚合酶等细菌系统的发现及应用,在过去彻底改变了分子生物学。有了RNA导向Cas9酶,细菌现在为我们提供了重新基因组序列信息的一个通用工具,其具有在生物技术和医学中改造基因组工程景观的潜力。

(生物通:何嫱)

生物通推荐原文索引:

Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems.Science: Vol. 339 no. 6121 pp. 819-823 DOI: 10.1126/science.1231143

RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9.Science: Vol. 339 no. 6121 pp. 823-826 DOI: 10.1126/science.1232033

A library of TAL effector nucleases spanning the human genome.Nature Biotechnology. Year published:(2013)DOI:doi:10.1038/nbt.2517

RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems.Nature Biotechnology.Year published:(2013)DOI:doi:10.1038/nbt.2508

Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system.Nature Biotechnology.Year published:(2013)DOI:doi:10.1038/nbt.2501

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