Cell新突破：CRISPR技术助力干细胞基因组编辑

CRISPRs技术成为了最近的新宠儿，这种基因组编辑技术更易于操作，也具有更强的扩展性，近期来自哈佛大学，Broad研究院等处的研究人员利用CRISPRs技术进行人多能干细胞基因组编辑，并指出这种方法比TALENs方法更有效。

　　生物通报道：CRISPRs技术成为了最近的新宠儿，这种基因组编辑技术更易于操作，也具有更强的扩展性，近期来自哈佛大学，Broad研究院等处的研究人员发表了题为“Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs”的文章，利用CRISPRs技术进行人多能干细胞基因组编辑，并指出这种方法比TALENs方法更有效。

CRISPRs全称为规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，这是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。研究表明，CRISPR与一系列相关蛋白、前导序列一起，能为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫能力。

这种结构的作用机理可能与真核生物的RNA干扰过程类似，最早于1987年在大肠杆菌（Escherichia coli）K12的iap基因侧翼序列中被发现。今年2月来自哈佛大学的研究人员在另外一篇“A TALEN genome-editing system for generating human stem cell-based disease models”文章中，采用了TALEN方法，在培养体细胞和人多能干细胞中快速生成了15个基因的突变等位基因，其中多能干细胞能分化成各种代谢细胞类型。这能用于疾病研究模型。

此外今年1月，哈佛大学的遗传学家George Church 和他的同事利用CRISPR方法，成功编辑了几种不同的人类细胞系的基因组，其中包括诱导多能干细胞iPS。这与另外一篇Science文章首次证明了Cas9 核酸酶确实能用于编辑哺乳动物细胞基因组。

作者指出CRISPR比较于其它基因组工程技术，比如锌指核酸酶 (ZFNs) 或转录激活因子样效应物核酸酶（TALENS），具有极大的优势，CRISPR更易于操作，也具有更强的扩展性。

为了进一步比较TALENs和CRISPRs的相对作用效率，在这篇文章中，研究人员利用这两种方法利用同一平台，对同一hPSC细胞系的同一基因组位点进行了分析，结果表明CRISPRs方法的效率更高，TALENs对一个突等位基因产生克隆的效率是0%-34%，而CRISPRs方法的效率则为51%-79%，并且后者还能较容易的生成纯合子突变克隆（总克隆的7%-25%），此外这种方法也比TALENs方法敲入克隆比例高出近十倍。

研究人员推测CRISPRs的这种突出性能是由于Cas9蛋白能更高量的表达，在hPSCs中也比TALENs具有更好的耐受性，其它方面的原因也可能是由于Cas9的内源性DNA未蜷曲活性，而TALEN受损后会结合甲基化DNA等。

但是CRISPRs也存在一些缺点，其中尤其值得注意的是两点：首先G(N)₁₉NGG的要求有时会出现限制性，其次CRISPRs方法的脱靶率还有待进一步确定。

这些分析都进一步指出了CRISPRs方法的各方面优缺点，如果需要进行这方面的研究，可以细细参读这篇重要的文献。（生物通：张迪）

原文摘要：

Enhanced Efficiency of Human Pluripotent Stem Cell Genome Editing through Replacing TALENs with CRISPRs

Transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) systems are new classes of genome-editing tools that target desired genomic sites in mammalian cells (Miller et al., 2011; Hockemeyer et al., 2011; Cong et al., 2013; Mali et al., 2013; Jinek et al., 2013). TALENs bind as a pair around a genomic site in which a double-strand break (DSB) is introduced by a dimer of FokI nuclease domains. Recently published type II CRISPR/Cas systems use Cas9 nuclease that is targeted to a genomic site by complexing with a synthetic guide RNA that hybridizes a 20-nucleotide DNA sequence (protospacer) beginning with G and immediately preceding an NGG motif recognized by Cas9constituting a G(N)19NGG target DNA sequenceresulting in a DSB three nucleotides upstream of the NGG motif (Jinek et al., 2012). However it is generated, the DSB instigates either nonhomologous end-joining (NHEJ), which is error-prone and conducive to frameshift mutations (indels) that knock out gene alleles, or homology-directed repair (HDR), which can be exploited with the use of an exogenously introduced double-strand or single-strand DNA repair template to knock in or correct a mutation in the genome.