#微孔板秘笈6#利用SynergyH4 的光散射方法监控E.coli生长[创新技巧]

【字体: 时间:2013年04月25日 来源:BioTek

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  生物通联合BioTek在2013年重磅推出#微孔板秘笈#,为您介绍微孔板相关检测产品的应用。4月份我们将聚焦微生物检测。监控细菌生长是生命科学研究中重要的手段。带有温度控制的微孔板检测仪可以检测大量的样本并记录生长抑制效应。本文描述了使用Synergy™ H4 多功能微孔板检测仪监控不同波长下 E. coli 生长及乙醇的抑制作用。

Ted Quigley, Applications Specialist, Applications Dept., BioTek Instruments, Inc.

监控细菌生长是生命科学研究中重要的手段。带有温度控制的微孔板检测仪可以检测大量的样本并记录生长抑制效应。本文描述了使用Synergy™ H4 多功能微孔板检测仪监控不同波长下 E. coli 生长及乙醇的抑制作用。

介绍

对细菌和酵母进行定量分析是分子生物学研究的重要手段,尤其是在评价质粒转染到E.coli 后导致重组蛋白产生的研究中非常重要。E.coli 最终产量可以归一化为细菌的标准产量,而抑制反应可以通过细菌生长密度来进行研究。测定E.coli或其它细菌在600nm 的吸收波长是最常用的监控细菌生长密度的方法。

目前,大量的研究均采用了微孔板检测器,通过检测在600nm 下的吸收波长来监控细胞生长密度。Stubbings, et al通过和传统方法相比后,证实了使用微孔板测600nm 可以用于抗生素后效应的研究1。同时Shapiro 等通过在600nm 下检测溶源体的生长密度,建立了一种用来测定可以干扰原核翻译的抗菌剂半致死浓度的方法2。Brocklehurst 等通过在600nm 下检测经24h 处理后存在各种金属的不同培养基的MICS(最低抑制细菌生长浓度)来观察不同种E.coli 对金属离子的耐受性3。Chekmenev 等在用一种改良的方法来研究源于鱼、酰胺化及未酰胺化鱼素1,3 的两亲阳离子抗菌肽时,也采用了600nm 波长监控抗菌肽的生长,且其研究所得到的MICS(最低抑制细菌生长浓度)已经被公布4。Lauths 等从杂交条文鲈的皮肤和腮分离了一种新的抗菌肽moronecidin,同样采用600nm 波长来监控moronecidin 生长5。Blanchard等应用了同样的方法观察了E.coli 的OxyR 和SoxRS 系统与SoxRS 依赖基因及SoxRS 不依赖基因的相互作用,而这些基因会受胁迫产生的超氧化合物所调节。

上述研究表明,可以通过对600nm 下吸收光值的检测来监控细菌的生长密度,与此同时为了避免长时间细菌培养过程中环境温度改变对其生长的影响,建议整个检测过程保持在37摄氏度进行。

BioTek 推出的多种检测仪可以在600nm 波长下监控细菌生长曲线并且能够控制温度在37 摄氏度,包括最新的拥有Hrbrid技术的SynergyH4、 SynergyH1 全功能微孔板检测仪和Synerg2、SynergyHT 多功能微孔板检测仪、基于单色器光路的Powerwave、Eon 系列微孔板检测仪,和基于滤光片光路的ELx808IU 微孔板检测仪。本文介绍了BioTek 微孔板检测仪在进行细菌生长实验研究中的能力和揭示了一些生长抑制剂如乙醇对细菌生长的影响。本实验采用的是拥有Hrbrid 技术的SynergyH4 多功能微孔板检测仪,它整合了波长选择灵活的四光栅- 氙灯光路和高灵敏度的滤光片- 卤素灯光路,可以满足荧光蛋白、时间分辨荧光、FRET 和TRFRET,荧光偏振、离子通道比率实验以及基于滤光片的发光实验如BRET,BRET2 和AlphaScreen® 等需要的较高灵敏度的检测实验。下述实验采用了SynergyH4 的光路系统:基于氙灯- 单色器的吸收光检测光路来完成。

材料和方法

菌株类型为E.coli 的DH5α;LB 培养基购于Sigma-Aldrich,货号为L3022 (St. Louis, MO) 并按说明书配制;100% 乙醇购于Fisher Scientifi c,货号为A962-4;灭菌微孔板( 货号3603) 及UV 透射微孔板( 货号3635) 购于Corning Life Sciences;Gen5TM 控制的SynergyH4 检测仪由BioTek Instruments, Inc 所提供。每个样本做8 个重复,每排为不同的实验处理。第1 排到第6 排包含不断递增的梯度,酒精浓度如下表所示,第7 排到第12 排包含195 μL 培养基和5μL 细菌培养液.

操作步骤如下:
1.设定温度为37°C
2.将微孔板置于检测仪中,中等速度震荡10 秒
3.温度一直控制在37°C,24h 内每隔5min 读取下述波长值:340 nm, 570 nm, 600 nm, 630nm, 800 nm 和 850 nm
4.读数间隙设置为低速震荡(连续设置)

读数结束后,将其中一孔的物质转移到Corning 3635 UV 板的一孔中,从200 to 999 nm 每隔1nm 进行光谱扫描( 图 3).

结果

没有用乙醇处理的孔表现出一致的增长趋势从0.8OD 开始进入平台期如下图所示(图 1).

图1 典型的E.coli 生长曲线。分别在340,570,600,630,800 和850nm 波长下24h 内每隔5 分钟读数,期间振荡。上图是600nm 下典型的生长曲线图

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乙醇的抑制影响

如图2 及下表所示,第1 排到第6 排乙醇的浓度逐渐降低,第7 排开始不加乙醇。结果表明第一排乙醇浓度最高,细菌无明显生长曲线。

图2 不同乙醇浓度处理下细菌生长曲线比较。

不同波长监测细菌生长曲线

读取600nm 波长下的吸光值是传统的监测细菌生长的方法。然而,选择600nm 吸光值只是源于光的散射现象,并且不是所有的检测仪都可以具备600nm 检测能力。通过对H-12 孔物质的波长扫描来观察不同检测波长对最终结果的影响。将该孔的物质转移到Corning 3635 UV 透射板中来确认600nm是否为其特异吸收峰,其它检测波长是否可行以及是否能用光路径校正功能换算1cm 的光程路径。如图4 所示,600nm 波长检测结果和其它波长结果并没有明显差异,也就是说,理论上可以采用其它波长检测来观察到类似的生长曲线。由于一些其它物质,如微孔板本身或溶剂在短波长(e.g.340nm) 有光吸收,因此不适用于进行光散射实验。因此,600nm 仍然是最为经典的检测方法,也是唯一被文献所引用的。

为了直接把微孔板检测到的生长曲线结果和分光光度计的结果进行比较,我们需要做一个校正换算。BioTek 的自动光程路径校正是基于溶剂的特殊吸收峰的原理。在水溶液中,纯水在977nm 下有特定的吸收峰。而通常在900nm 的非特异性吸光值则被用来做相应的背景扣除,如塑料。但光程路径校正无法用在细菌生长监测的校正,因为细菌生长测定是基于光散射原理而不是光吸收。如前所述,这些实验中所有的波长其实都具有散射光,其中包括977nm,900nm,这样就会影响到光程路径校正。200μL 水溶液在977nm 的吸光值应该比900nm 大0.1OD 左右,而实际上,977nm 和900nm 的吸光值分别为0.883 和0.870,这0.013 的差异表明了其它物质在这些波长下出现了吸收光或散射光的情况,而这些因素就影响了光程路径校正方法在细菌生长监测上的使用。更为有效的进行光程路径校正的方法是在进行细菌生长曲线监测之前,确定特定孔中用水或有颜色吸收染料液体的光程路径。这种光程路径的计算可以作为一种数学换算的常量用来校正每孔的值为1cm 的光路径值。

图3 DH5α- E.coli 细菌和培养基的光谱扫描图。细菌生长实验中板内物质转移到corning 3635UV 紫外透射板中,用SynergyH4 多功能微孔板检测仪进行光谱扫描,从200nm-999nm(1nm 步进)

图4 不同波长吸收光检测。不同波长监控细菌生长并用Gen5 软件绘图。每孔用5 种波长检测:570nm,600nm,630nm,800nm 和850nm

讨论

上述数据表明BioTek 的SynergyH4 多功能微孔板检测仪可以在各种波长下(包括经典的600nm)进行细菌生长曲线的监测。细菌的生长依赖于培养基及抑制剂的缺失,且细菌生长除了经典600nm 波长检测外也可以在其它波长下进行监测。

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参考文献

1. Stubbings, W.J., Bostock, J.M., Ingham, E., and Chopra, I.,(2004) Assessment of a microplate method for determining the post-antibiotic effect in Staphylococcus aureus and Escherichia coli, J Antimicrobial Chemotherapy 54(1): 139-143
2.Shapiro, E. and Baneyx, F. ( 2002 ) Stress-Based Identification and Classification of Antibacterial Agents: Second-Generation Escherichia coli Reporter Strains and Optimization of Detection, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 46(8): 2490-2497
3. Brocklehurst, K.R., and Morby, A.P. (2000) Metal-ion tolerance in Escherichia coli: analysis of transcriptional profi les by gene-array technology. Genetics and Molecular Biology 146: 2277-2282
4. Chekmenev, E. Y., et al (2006) Investigating molecular recognition and biological function at interfaces using piscidins, antimicrobial peptides from fish, Biochimica et Biophysica Acta 1758: 1359-1372
5. Lauth, X., et al (2002) Discovery and Characterization of Two Isoforms of Moronecidin, a Novel Antimicrobial Peptide from Hybrid Striped Bass, Journal of Biological Chemistry 277: 5030-5039
6. Blanchard, J.L., Wholey, W., Conlon, E.M., and Pomposiello, P.J. (2007) Rapid Changes in Gene Expression Dynamics in Response to Superoxide Reveal SoxRS-Dependent and Independent Transcriptional Networks, PloS One 2(11): e1186
7. DNA Cloning, A Practical Approach Volume 1 (1985) Glover, D.R. Editor, IRL Press, Washington,DC AlphaScreen® is a registered trademark of PerkinElmer.

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