如何选择siRNA转染试剂

【字体: 时间:2013年05月21日 来源:生物通

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  RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的转录后基因沉默机制,现在RNAi已成为检测基因功能的一个必要工具。将siRNA导入细胞的途径很多,例如可以将siRNA编码在质粒或病毒中,先在细胞中形成较长的RNA片段,再加工成为siRNA。此外还有电转法、显微注射和化学试剂介导的转染等等。

生物通报道:RNA干扰(RNAi)是由双链RNA介导的转录后基因沉默机制,现在RNAi已成为检测基因功能的一个必要工具。人们一般用约22个核苷酸的小RNA(称为siRNA)来knock down基因,这些siRNA与目标基因的mRNA序列互补,能够破坏这些信使RNA使之无法翻译成为蛋白。

siRNA导入细胞的途径很多,例如可以将siRNA编码在质粒或病毒中,先在细胞中形成较长的RNA片段,再加工成为siRNA。此外还有电转法、显微注射和化学试剂介导的转染等等。转染siRNA通常并不需要特殊仪器,对实验操作的要求也并不高。人们一般将能中和负电荷的分子与siRNA结合起来,帮助siRNA与带负电的细胞膜相互作用。

siRNA专用试剂

早在发现siRNA之前,人们就已经开始用载体将核酸转染进细胞了,这些载体包括CaPO4、多糖(DEAE-dextran)、脂质、多肽等等。随着siRNA技术的普及,越来越多的商业化转染试剂能够支持siRNA应用,市面上也出现了大量的siRNA专用转染试剂。不过,商家通常不会透露他们的产品成分,只提供“阳离子脂质型”、“聚氨酯型”、“多聚体型”、“脂质包被的氧化铁纳米颗粒”或“脂质与其他成分混合”这样的描述。

与通用转染试剂相比,siRNA专用试剂是否一定效果更好呢?关于这一点,研究者们的意见并不一致。一些研究人员认为,siRNA专用试剂比通用试剂的效果更好,因此推荐将专用试剂作为首选。例如,希望之城癌症中心负责RNAiClaudia Kowolik指出,与转染质粒的Lipofectamine 2000相比,Life TechnologiesRNAiMAX效果要好得多。不过,纽约大学RNAi中心的Chi Yun并未发现siRNA专用试剂对转染效果有显著提升。当然,如果需要将siRNA和质粒共转染又另当别论。在这种情况下,专家推荐尽量使用通用试剂。

多查多问多试验

市面上的转染试剂品种很多,商家们还在不断推出新产品,如此多的选择难免令人感到无所适从,怎样才能找到最适合自己的产品呢?转染试剂的选择主要取决于细胞类型、细胞种属和下游实验。

细胞系不同,它们所需的转染条件自然也不相同。举例来说,悬浮培养的鼠类原代细胞,就比贴壁培养的人类细胞更难转染。此外,神经元和巨噬细胞也令人颇为头疼,标准方法很难将siRNA转染进去。

不论是哪种情况,经验数据都具有无可取代的价值。查阅文献,与其他研究者多交流都能获得宝贵的信息。当然,我们也可以在供应商提供的资料中,查看已成功转染的细胞类型。尽管这些资料中可能并没有siRNA转染的专门信息,“但了解转染试剂已经成功转染了哪些细胞,是很有帮助的,”Yun说。

此外,我们可以向商家索要一点样品,或者向同事借用一些,对自己的细胞进行试验。幸运的话,在几天内就可以锁定合意的产品。在这里花少许时间,总好过因为实验结果不理想而要重头再来吧。

评估与优化

在测试转染试剂的效果时,我们应该主要关注两点:siRNA是否进入了细胞,以及转染试剂的负面影响如何。如果所用试剂在这两个方面都不达标,那就赶紧换一个试试吧。

检验试剂转染能力的最直接途径是,用试剂转染已知效果的siRNA,然后再对转染效果进行评估。此外,市面上也有一些非特异性的荧光标记siRNA,可以作为转染的阳性对照。不过,Yun觉得这类对照并不称心,在她的实验中就算没有转染试剂,荧光标记siRNA也会粘在细胞外,使整个细胞发光。

siRNA的脱靶效应往往会造成意外的影响,“如果你想要真正保证一切正常,就得通过芯片,确定转染没有影响到太多的其他基因,”Kowolik解释道。“不过这样太麻烦了,我通常只是选取健康细胞进行后续实验。”

在选定转染试剂之后,对实验参数进行优化也很重要,例如转染试剂和siRNA的用量(采用最小的有效剂量),转染时间,以及检测转染效果的时机。Yun推荐,最好通过RT-PCR和下游实验来进行优化。

最后的选择

在基本选定转染试剂之后,最好再与商家确认一下该试剂的操作步骤,例如是否需要无血清培养基,是否需要更换培养基等等。选择与自己实验流程相符的转染试剂,可以帮你省去不少麻烦。

 

Josh P. Roberts撰写/叶予编译)

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