两篇Nature文章：5种RNA测序法一决胜负

　　

生物通报道  来自哈佛-麻省理工Broad研究所的研究人员，近日将5种不同的转录组测序（RNA-seq)法进行了对比，比较结果显示RNase H技术在分析低质RNA样品方面优于其他技术，且价格最为便宜；SMART和NuGEN法适应于分析少量RNA。2篇研究论文在线发表在5月19日的《自然》（Nature）和《自然方法》（Nature Methods）杂志上。

论文的共同作者、哈佛-麻省理工Broad研究所高级研究助理Xian Adiconis说：“RNA在一段时间内会发生降解，我们一直在寻找一种方法来解决这一问题。我们尝试了不同的方法，最终我们发现RNase H法很好用，能够给出一致的结果。”

RNA-seq是一种利用高通量序列测定，来测序和定量RNA进行转录组分析的方法。然而当研究人员利用少量降解或少量残存的样本进行RNA-seq时，他们得到的是受损的结果。Adiconis说，当前有许多的方法和商业试剂盒可用于分析低质和低量的样本，但直到现在人们也只能在某种程度上依靠猜测对这些方法进行选择。

在第一篇Nature Methods论文中，该研究小组通过测试这些技术清除低质样本中核糖体RNA(rRNA)的能力，发现RNase H能够清除低质样本中几乎所有的rRNA，只有1%的量残存。而Ribo-Zero法留下了11.3%,的rRNA，NuGEN法留下了23.2%。此外，对于低质RNA，RNase H和Ribo-Zero法在大多数量度，例如文库复杂性（样本中文库复杂性越高，就越能更好地代表RNA）和覆盖均匀度等方面看起来更优。

研究小组随后采用真实样本：一个福尔马林固定、石蜡包埋的肾样本，以及一个分离过程中发生了降解的胰腺样本，比较了RNase H 和Ribo-Zero。最终，科学家们发现RnaseH优于Ribo-Zero，提供了略微更均匀的覆盖。

鉴于它们在特异针对性清除rRNA序列方式上的根本差异，总体而言，RnaseH和Ribo-Zero优于其他的方法。例如，RnaseH法是采用预先设计的DNA寡核苷酸结合核糖体RNA序列，随后RNase H酶消化DNA-RNA杂交物。“这种靶向性的方法相对不影响剩余的转录组，”论文的共同作者、Broad研究所博士后Rahul Satija说。

相比之下，其他的方法，如polyA筛选法、DSM和SMART，是通过筛选多聚腺苷酸mRNA（poly-adenylated mRNA）或是清除高度丰富的RNA种类的方法，来间接清除核糖体RNA。这些技术在清除核糖体RNA的同时，也引入了降解样品覆盖偏倚。

此外，Ribo-Zero、NuGEN和SMART商业试剂盒一个样本的成本，要大大高于DSN-lite和RNase H等其他方法。组装这些文库所需的劳动量大致相同，除了DSN-lite需要多一天之外。

尽管RNase H看起来是一个明显的赢家，一种方法的选择要主要是取决于研究目的。例如，NuGEN能够极好地应用于非常量小的样本。“我们测试是1 ng和100 ng的样本量，但实际NuGEN方法可以达到比这更低。它也非常适用于已经降解的RNA，”Adiconis说。

SMART方法也适用于微小样本，不过其要求RNA必须是完整的。在另一项发表在Nature杂志上，Adiconis和同事们利用SMART方法对单个免疫细胞的转录组进行了测序，揭示了这些单细胞在基因表达上的异质性。

该研究小组过去一直采用NuGEN来测量单个病毒颗粒的转录组，单个病毒颗粒的RNA量不超过1皮克。“但我们从未尝试过用NuGEN法来检测单细胞，因此我们不能说它更好一些，”两项新研究的共同领导者、基因组测序和分析项目部（GSAP）Joshua Levin说。

（生物通：何嫱）

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