#微孔板秘笈7#啤酒酿造过程中酵母菌株的生长监测[创新技巧]

生物通联合BioTek在2013年重磅推出#微孔板秘笈#，为您介绍微孔板相关检测产品的应用。发酵用酵母菌株在多数食品工业领域扮演着重要的角色，比如啤酒、面包和红酒。本文介绍了使用Synergy™ H1 全功能微孔板检测仪，在96 孔板内进行温度控制、液体振荡、和菌株生长监控的完整流程。

Paul Held Ph.D., Principal Scientist, Applications Dept., BioTek Instruments, Inc.

发酵用酵母菌株在多数食品工业领域扮演着重要的角色，比如啤酒、面包和红酒。啤酒或红酒在发酵过程中，酵母将糖、氨基酸、多肽、蛋白质、核酸和其他复合物转换为酒精、二氧化碳以及饮料所需要的独特风味。为了能够得到稳定而理想的产量，并保持口味的稳定，就必须严格控制生产原料和整个发酵过程中酵母菌株的生长。同理，新菌株的研发也需要监控其在不同条件下的生长情况。本文介绍了使用Synergy™ H1 全功能微孔板检测仪，在96 孔板内进行温度控制、液体振荡、和菌株生长监控的完整流程。

介绍

酵母是一种单细胞真核菌类有机体，可以通过出芽或分裂进行无性繁殖（图1）。然而酵母可以改变自身大小，常规酵母的直径为3-8μM 酵母是科学研究中最常使用菌种，烘培及发酵也几乎成了酵母的代名词。

图1. 酵母

酵母已经有上千年的使用历史，被用于酿酒。法老墓的壁画中向我们展示了古代埃及人如何使用酵母酿造酒类饮料。同时面包的诞生也向我们阐释了酵母具有至少5000 年的使用历史1。直到18 世纪，生物学家才得以揭示酵母的发酵特性可以将糖类发酵成为酒精，同时产生二氧化碳。也就是从那时起，烘培师，科学家和发酵工业开始研发特定需求的酵母菌株。

酵母的生长阶段：

用于酿造啤酒的酵母，其生长过程固定，可以被分为4 个阶段：(1) 缓慢期; (2) 指数期；(3) 减速期；和(4) 稳定期。在缓慢期基本没有新的酵母生长发生，此时酵母处在环境适应阶段。随后的指数期，细胞迅速增长并分裂，养料与细胞数目极度相关。废物被稀释后其含量可以忽略。在这一期酵母的生长遵循第一动力学曲线。随着酵母数量的增加，细胞的生长速度开始减慢，随着一些参数( 如饱和废物量) 的变化，饱和效应开始明显，最终酵母生长达到稳定期，由于高废料浓度和底物的完全消耗，已经不能监测到细胞的生长( 图2)。

图2. 典型的酵母生长曲线，酵母培养于YPD 培养基中，30°C，12 小时，每2分钟观测一次。

芽殖酵母的分裂特性，可以让我们从大量的酵母突变体中筛选到表达我们所需要特性的克隆。每一个突变体都分裂自原始的第一代酵母。为了选到具有特定属性的酵母克隆，一种办法就是在特定的环境下，对酵母的生长进行监控。本文采用Synergy™ H1 多功能微孔板监测仪，保证在稳定的温度环境下，提供持续的轨道振荡，同时采用吸收光测定来监控酵母在不同环境条件下的生长。

材料和方法

YPD 培养基粉，氯化钠，单价和二价磷酸盐，乙醇购自Sigma- Aldrich (St. Louis MO)。 YPD 培养基按照说明书进行制备，并高压灭菌。消毒的平底透明微孔板，货号3598购自Corning (Corning, NY)。 透明的TopSeal®-A 封板膜，货号6005185，购自PerkinElmer (Boston, MA)。 不同的酵母菌株购自Wyeast Laboratories (Odell, OR)。所有实验采用相同的处理流程。过夜培养的母液 (50mL) 种植于250mL的Erlenmeyer 管中，30°C 培养，125RPM 轨道振荡。在培养实验前，取150μL 过夜培养的母液，稀释于7.5mL 的新鲜1×YPD 培养基中。稀释后的酵母细胞，按照需要种植于Corning 3598 平底透明板中。采用持续轨道振荡模式每隔2分钟监测一次。振荡速度设定为慢速，振荡频率设定为559 (1mm 振幅)。温度控制设置为30°C。细胞生长通过OD600nm 的吸收光散射来测定2。每孔的吸收光监测数据通过Snergy H1 多功能微孔板检测仪 ( BioTek Instruments, Winooski, VT ) 的动力学模式进行采集。该检测仪通过Gen5™ 仪器控制和数据分析软件进行仪器控制和数据分析（BioTek Instruments, Winooski, VT）。

结果

细胞数目效应

Budvar2000 淡啤酒酵母过夜培养，然后根据需要使用YPD培养基稀释。稀释后的样品(200 μL/ 孔)，加入微孔板中，并采用8 次重复。对每孔进行600nm 吸光度的跟踪监测。吸收光监测数据显示随着细胞数目的增加，吸光度也随之增加（图3）。由于细胞在溶液中成悬浮状态，检测结果其实主要反应的是光的散射而非真正的吸收光，因此结果并不遵循琅勃比尔定律，也并不必要呈现线性。所得到的数据适合二次方程分析。

图3.Budvar 2000 淡啤酒酵母菌株的吸光图。

生长均一性

整板酵母生长的重复性检测是比较研究中所必须的步骤。当单一克隆来源的Budvar 2000 淡啤酒酵母被种植于96 孔板的所有孔内，每孔的生长模式均一致（图4）。如前所述，过夜培养的母液，采用YPD 培养基稀释后，在96 孔中每孔加入200 μL 稀释菌液。所有培养样品在600nm 下的平均吸光度为0.156，CV 值为2.6%。菌液培养20 小时后，板内平均吸光值为1.516，CV 值为1.5%。不同行与列孔间实验前后的吸光值相似。

图4. 动力学吸收光模式监测Budvar2000 淡啤酒菌株生长。

当对不同孔的细节进行详细比较时，可以观测到微小的不同。这些细微的不同，不仅仅在实验初始和结束时能观测到，也可以在实验期间的数据点中观测到（图5）。所有孔平均的log 相生长速率是3.68mOD/min，CV 值是2.48%。该数据意味着不同实验条件下的log 相生长速率可以做为相互比较的参数。

图5. 不同孔中酵母细胞生长比较。30°C 所有96 孔中Budvar2000 淡啤酒酵母动力学吸收光监测数据图。

温度敏感性

温度条件是酵母生长的一个重要指标。我们监测4 种不同酿酒酵母菌株的生长情况，将过夜培养的酵母菌株原液稀释后种植于96 孔板中，每个样品做22 次重复，并做8 个对照孔，对照孔内为YPD 培养基。同样样品分布的板共六块，并在不同检测仪的特定温度下进行动力学分析。如图6 所示，Budvar 淡啤酒酵母在室温至37°C 之间没有明显生长变化。当达到40°C 时，缓慢期轻微延伸，但是更重要的是指数期的生长速率下降，静止期的细胞数目比低温时观测到的少。当培养温度达到45°C 时( 如图6 )，几乎观测不到酵母细胞的生长。其他3 种酵母菌株所观测到的情况也相同（数据没有显示）。

图6. Budvar 淡啤酒2000 酵母的温度生长效应。酵母在相应的温度下生长平行。

当我们将四种酵母限定在指数期，可以比较不同菌株的温度耐受性。在指数期观测生长速率，绘制每一点的吸光值，可以发现不同菌株的温度耐受和生长速率有明显不同（图7）。当测定吸光值改变时，两种淡啤酒菌株在37°C 以下生长速度最快。两种浓啤酒菌株（1098 和1469）在相应温度下显示较慢的生长速率，以及与其他菌株相比，对温度升高耐受性较低。

图7. 温度对指数生长期生长速率的影响。

乙醇耐受

酵母在有糖类存在下进行发酵产生乙醇和二氧化碳。当废物的量变得明显增加时，这些废物的存在则影响酵母细胞的增长。过夜培养四种不同的酿酒酵母菌株，每种菌株被稀释后150μL 培养于96 孔板中，每个菌株进行22 个重复。每孔中再加入50μL 乙醇/YPD 不同配比的混合液，每种配比条件重复两次。当进行乙醇影响检测时，发现高浓度乙醇可以影响酵母的生长。以UrqueII2001 淡啤酒酵母生长为例，酵母所能耐受的乙醇浓度为2.5％或更低。高于此浓度水平酵母菌株的生长明显降低。如图8 所示。在指数生长期，其他酵母菌株也观测到了相同的生长速率。在进行测试的几种菌株中，Budvar2000 表现出最好的耐受性，当乙醇浓度达到5% 之前，都没有显示生长下降。British 淡啤酒酵母可以耐受2.5％的乙醇，而其他两种菌株的生长随着乙醇的浓度增加而显示生长抑制。( 图9 )

图8. UrqueII2001 淡啤酒酵母生长曲线的乙醇效应。

图9 自动分析性能数据

pH 敏感性

为了测试pH 值对酵母生长的影响，四种不同的啤酒酵母进行过夜培养，将150μL 培养于96 孔板中，并做22 个重复。每孔再加入50μL 50mM的磷酸盐，pH范围在4.5 至9.5 之间，每种菌株在不同pH 条件下，做两个重复。与碱性环境相比较，酵母更喜欢在酸性环境下生长。对1469 Timothy Taylor 淡啤酒酵母的生长检测，充分支持了酵母对酸性环境的生长偏好。在pH 水平在4.5 至6.0 之间时，酵母的生长和正常条件下酵母细胞的生长，基本没有区别。( 图10 ) 当pH 值达到6.5 时，细胞生长缓慢，但可以达到静止期的细胞浓度，不过该过程需要3-4 个小时。当pH 值达到7.0 或更高水平时，酵母细胞的生长速率和浓度均明显下降。

图10. pH 对1469 TimothyTaylor 淡啤酒酵母生长的影响

当检测其他酵母菌株时，结果有所不同。2001 和1098 菌株显示和1469 相同的生长模式。而2000 则显示在偏碱性pH值环境中生长率增加。( 图11) 有趣的是四种菌株的生长速率均低于没有进行特殊环境控制的菌株，也就提示我们，磷酸盐本身就对酵母的生长具有抑制作用。

图11. pH 值在指数期对生长速率的影响。

盐敏感性

培养基的离子强度也是当使用非去离子化处理的公共用水或井水等水源所需要关注的问题。这类饮用水还有大量的离子。然而这些离子物质可以增加或降低水的口感，并且根据其组成不同，有可能会抑制酵母的生长。酵母的生长对氯化钠的浓度具有较高的耐受性，我们可以过添加外源性的NaCI 来评估离子强度对酵母生长的影响。如前面实验所述，不同酵母菌株过夜培养，稀释液150μL 加入为96 孔微孔板，做22 个重复，另外每孔再加入50μL 浓度范围在0-1.25M 的NaCI，观察每种酵母在不同浓度下的生长情况，每个浓度点做两个重复。Urquell lager 2001 酵母在NaCl 浓度为125mM 时所表现的生长情况和未处理的对照组没有明显差异，这些浓度当产生了高渗透压，则需要考虑是否平衡或加入水进行稀释。当盐浓度达到250mM 和375mM 时生长速率有所下降，但与对照组相比并不十分明显。只有当NaCl 的浓度高达500mM时，才观测到明显的生长下降。( 图12 )

图12. 氯化钠对Urquell lager 2001 酵母生长的影响

我们计算了四种不同酵母在盐浓度为2.5M 下，指数期的生长速率。毫无疑问，所有酵母在NaCl 浓度升高后，生长速率明显下降。( 图13 ) 在其他实验中，Budvar 2000 菌株在NaCl浓度为500mM 或更低时，显示最快的生长速率。有趣的是，当盐浓度在500mM 以上时，1469 淡酵母菌株显示最快的生长速率，不过这种变化与非处理对照组的差别并不明显。

图13. 氯化钠对酵母生长指数期的影响。

本实验中所选取的酵母菌株，均为经过多年筛选，特别用于啤酒酿造的菌株。除了生长以外，其他特性，如透明度，沉淀率，起絮度，风味，香气等在酵母菌株的选取中都至关重要。在北欧大量啤酒的生产在低温下完成，而不列颠半岛上则生产淡啤酒。Budvar lager 2000 酵母在测试中表现出最好的温度耐受性。虽然没有进行测试，但也提示我们改菌株可能在低于环境温度的情况下也可以具有生长优势。而1469 Timothy Taylor 菌株则在较高离子浓度下体现出良好的生长活性，很有可能更适合在大不列颠区域的硬水中生长良好。

在本实验中所采取的连续动态学观测需要几个要素。均一的温度控制，保证酵母在96 孔板中的每一孔细胞在悬浮状态下均一的生长。Synergy™ H1 的4-Zone 加热系统，可监控孵育的温度并在检测仓的不同位置进行加热，保证微孔板全板温度的均一。实验中，经常会忽略到蒸发效应，因此微孔板需要进行密封。长时的动态观测，最好选用粘性封条来防止蒸发所造成的液体损失。

每一微孔中液体的体积也是一个重要的参数，过多的液体会在液体和板盖之间产生微小的气泡，这些气泡在进行吸收光检测时产生干扰。较少的培养液，则在孔内留有大量的空气可能会导致过量的水蒸气饱和所造成的液体挥发，这样即减少了酵母培养液的量，也可能增加孔板上方接近密封处水的凝集。所凝集而成的小液滴所产生的问题同前面谈到的小气泡所引起的问题是一样的。SynergyH1 的孵育仓的顶部和底部有加热原件，可以减少液体凝集现象的产生。

为了保证细胞的悬浮状态，选择振荡的模式和速度也非常重要。根据酵母细胞的大小和具有成团聚集的特性，必须选择轨道振荡来保证细胞的悬浮。根据对酵母菌株的观测，慢速设定一个短振幅（1mm）的振荡速度（559cpm）即可提供足够的振荡力保证整个生长期间细胞的悬浮。同时振荡对静止期酵母产生絮状凝结时尤为重要。不同的酵母菌株，不同的孔板类型所需的振荡设定均不同。

本文中的实验采用长时间动力学运行，对酵母菌株的生长能力进行分析。值得注意的一点是，除了生长速率明显不同之外，很多不同的培养条件最后的细胞浓度则是相同的。可以通过Gen5 软件对指数期动力学反应的平均速率改变或者MeanV进行自动数据分析。还可以选择特定的含有指数生长期的动力学进行自动分析。

本文的数据展示了采用Synergy™ H1 对酵母细胞生长进行动力学监测。酵母生长需要持续温度控制和合适的振荡条件，才能得到均一可重复的结果。足够的振荡除了将营养成份进行充分悬浮利于细胞生长外，还可以在监测时保证准确均一的光散射值。

Synergy H1 具有不同的振荡方式可选，包括线性，轨道和双轨道或定义8 种不同振动模式。每种模式可以调整速度和振幅，为不同的实验样本提供一些列不同的混合条件。

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参考文献

1. Jean-Luc Legras, Didier Merdinoglu, Jean-Marie Cornuet and Francis Karst. (2007.). "Bread, beer and wine: Saccharomyces cerevisiae diversity reflects human history”. Molecular Ecology 16 (10): 2091–2102.

2. Stubbings, W.J., Bostock, J.M., Ingham, E., and Chopra, I., (2004) Assessment of a microplate method for determining the post-antibiotic effect in Staphylococcus aureus and Escherichia coli, J Antimicrobial Chemotherapy 54(1): 139-143.