Nature Methods：磷酸化与泛素化的交互应答

　　

生物通报道  美国华盛顿大学等机构的研究人员对蛋白降解过程中磷酸化与泛素化的交互应答进行了整体分析，发现不同的磷酸化位点往往同时发生泛素化。这项研究成果于近期在线发表在《Nature Methods》杂志上。

蛋白的翻译后修饰（PTM）功能作为高度灵活的开关，调控着蛋白活性、浓度以及亚细胞定位。蛋白的一个或多个残基可被修饰，赋予特定的蛋白调控。然而，蛋白的翻译后修饰存在交互应答（cross-talk），即一种修饰的存在会影响其他的出现，这种现象的基础仍然不明。

真核生物蛋白质组中存在两种最普遍的翻译后修饰，磷酸化和泛素化，它们在几乎每个细胞过程中都是不可缺少的。磷酸化是调节细胞信号转导的主要机制，而泛素化在蛋白降解中发挥了重要的作用。磷酸化和泛素化之间的交叉调控可采取很多形式。

然而，到目前为止，大部分研究都只关注一种类型的修饰，这主要是鉴于两方面的限制。首先，修饰往往以低于化学计量的水平存在，需要高度特异的富集方法。其次，蛋白质组学通常在肽段上开展，而不是完整的蛋白，这种实验通常切断了单个蛋白异形体上多种修饰之间的关联。为此，华盛顿大学基因组科学系的Danielle Swaney等研究人员开发出两种富集策略，实现了共修饰蛋白的整体鉴定，并应用这些方法来研究蛋白降解背景下泛素化与磷酸化之间的交互应答。

（图片来自Nature Methods）

在第一种富集方法中，研究人员应用钴-NTA亲和纯化来富集酿酒酵母中经泛素（带His标签）修饰的蛋白。这种泛素富集后的群体称为泛素化蛋白，而穿流液则被称为未泛素化的蛋白。经过胰蛋白酶消化后，他们富集了这两部分蛋白中的磷酸化肽段。此外，为了鉴定泛素化蛋白中的单个泛素化位点，他们使用抗体来富集消化后泛素化的赖氨酸残基上仍存在甘氨酸-甘氨酸（diGly）的肽段。之后，他们利用纳米反向液相色谱（nRPLC）偶联串联质谱（MS/MS）来分析这三种样品（未泛素化的磷酸化肽段、泛素化的磷酸化肽段以及泛素化的未磷酸化肽段）。

第二种方法则是直接鉴定同时存在磷酸化和泛素化修饰的肽段。研究人员首先用胰蛋白酶将蛋白消化成肽段，随后利用强阳离子交换（SCX）层析来富集带双电荷的肽段。之后通过抗体对SCX组分进行进一步富集，并通过nRPLC偶联MS/MS分析。

通过这两种方法，研究人员鉴定出466个同时经泛素化和磷酸化修饰的蛋白。此外，他们应用这些方法来定量鉴定通过泛素-蛋白酶体系统调控蛋白降解的磷酸化位点。结果表明，不同的磷酸化位点通常也用于泛素化，且这些位点在整个磷酸化位点中更高度保守。最后，研究人员还探讨了磷酸化机制如何被泛素化所调控。

作者认为，翻译后修饰的交互应答是一个复杂且多层面的问题，且大部分还有待探索。而一些新的蛋白质组学技术，比如他们所使用的，如今提供了一种实用的方法，来鉴定修饰交互应答，并阐明其复杂性和影响力。（生物通 薄荷）

原文检索

Global analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk in protein degradation

Nature Methods (2013) doi:10.1038/nmeth.2519