利用454技术解析样本中病毒耐药突变情况[创新技巧]

H7N9是一种甲型流感病毒，是禽流感病毒的一个亚型，1988年在美国火鸡身上有了第一个病毒记录。H7N9原本属于低致病性感冒病毒，经基因交换后转移到人类上感染后成为病发期短、重症率与死亡率较高的传染性病毒。自今年3月下旬开始，人类感染甲型流感病毒H7N9的病例陆续在上海及长江三角洲一带的城市被发现。疫情爆发后，各地疾控中心与政府都采取了积极的应对措施，到5月中旬，已基本消除了新增病例。然而研究的步伐仍未停止，科学家们仍然在研究病毒基因重组的机制以及耐药情况的发生。

目前在临床上对H7N9的患者主要使用奥司他韦和帕拉米韦进行抗病毒治疗。为了直观地解析病毒基因耐药机制，测序仍然是主要的选择。国内学者们在收集病人在治疗过程中多个时间点的咽拭子、血液、尿液和粪便标本，使用自行设计的荧光定量RT-PCR方法对上述标本中的H7N9 流感病毒核酸载量进行了定量检测，并对其中的十四例患者进行了454测序，从而进行了病毒载量与病情严重程度的相关性分析，相关论文已发布在2013年5月的柳叶刀杂志中1。

通过对患者标本中的HA和NA病毒基因序列进行了扩增和高通量测序及分析。在病毒基因序列和多态性的研究发现，2例重症病例在抗病毒治疗过程中其体内H7N9毒株的神经氨酸酶（NA）292位氨基酸从R（精氨酸）突变为K（赖氨酸）。在上海地区最早的H7N9病毒（A/Shanghi/1/2013（H7N9））中也发现存在这一突变，但一直不清楚其临床意义。本研究结果将NA 292位氨基酸的R/K突变与临床治疗效果不佳和不良预后联系起来，并表明耐药的基因突变可以在临床抗病毒治疗过程中被诱导产生。

上述研究结果，一方面说明抗病毒治疗仍对绝大部分患者有效，一旦确诊应尽早治疗，同时提示在药物治疗前和治疗过程中有必要对病毒载量和耐药基因位点进行密切监测，及时调整治疗方案，以提高救治成功率；另一方面，研究结果也提示有关卫生主管部门对未来可能出现的H7N9耐药毒株的流行应予以高度关注，采取积极有效的防控策略，鼓励新型治疗方案的探索，加快新型抗病毒药物的研发。

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参考文献：
1. Association between adverse clinical outcome in human disease caused by novel influenza A H7N9 virus and sustained viral shedding and emergence of antiviral resistance. Hu Y, Lu S, Song Z, Wang W, Hao P, Li J, Zhang X, Yen HL, Shi B, Li T, Guan W, Xu L, Liu Y, Wang S, Zhang X, Tian D, Zhu Z, He J, Huang K, Chen H, Zheng L, Li X, Ping J, Kang B, Xi X, Zha L, Li Y, Zhang Z, Peiris M, Yuan Z. Lancet. 2013 May 29. doi:pii: S0140-6736(13)61125-3. 10.1016/S0140-6736(13)61125-3.