利用电穿孔仪转染siRNA要注意些什么[心得点评]

【字体: 时间:2013年06月06日 来源:生物通

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  对于基因表达分析而言,siRNA的转染是关键的第一步。目前主要有两种方法可导入siRNA:电穿孔和转染试剂。转染试剂用的比较多,但对于一些很难对付的细胞而言,如原代细胞和干细胞,转染试剂有时也不太奏效。利用电穿孔仪来对付这些细胞,似乎更加简单。然而,转染过程中要注意些什么呢?

对于基因表达分析而言,siRNA的转染是关键的第一步。目前主要有两种方法可导入siRNA:电穿孔和转染试剂。转染试剂用的比较多,但对于一些很难对付的细胞而言,如原代细胞和干细胞,转染试剂有时也不太奏效。利用电穿孔仪来对付这些细胞,似乎更加简单。然而,转染过程中要注意些什么呢?

使用低盐缓冲液

电穿孔是在高强度的电场作用下,在细胞膜的表面打开小孔,从而允许siRNA分子进入细胞。这种快速击穿发生在一个特别设计的电击杯内,其中包含了悬浮在低盐缓冲液中的细胞。为什么要使用低盐缓冲液呢?因为使用等渗或高渗缓冲液来悬浮细胞会导致电休克,杀死大部分细胞,致使转染效率低。

用复苏培养基来重悬转染后的细胞

在电穿孔之后,应当向细胞中添加一种适当的细胞培养基,以帮助它们快速恢复元气。培养基的类型应取决于您所使用的细胞类型。一般来说,您应当使用能刺激细胞周期的培养基,比如包含血清或生长因子的培养基。不过,如果您需要避免激活特定的细胞信号通路,那么可使用“低生长”的血清。重悬后的细胞应立即置于培养容器(如培养板、培养皿)中。

究竟要用多少siRNA?

在谈到优化siRNA的浓度时,请记住范围要宽。许多制造商都建议浓度在1 nM到30 nM。根据经验,10 nM适合大部分容易转染的细胞系,如HeLa细胞。然而,对于难转染的细胞,如原代细胞或干细胞,应尽量避免加入太多的siRNA,这样做会增加脱靶效应。研究表明,通过降低siRNA浓度可在很大程度上避免可能会对RNAi实验产生误导结果的脱靶效应。

定量转染效率

在一般情况下,转染效率不超过20%,因此尽管您采取各种措施来优化转染,还是应该设定切合实际的预期值。确定转染效率的一种方法是将siRNA分子与报告基因(如表达GFP的质粒DNA)共同转染。这对于难转染的细胞而言很关键,因为这些细胞的转染效率通常很低。如果不检查转染效率,那么很难确定siRNA是否进入了细胞。

始终避免RNase

尽管是老生常谈,但还是有必要提醒一下。在处理RNA时,每时每刻都要保证与样品接触的一切没有RNase污染。这包括电穿孔缓冲液、重悬培养基以及所有容器、移液器等。RNase的存在不仅在转染过程中破坏siRNA,还在分析过程中破坏总RNA和mRNA。因此,去除RNase是siRNA实验成功的前提条件。(生物通 薄荷)

 

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