高手教您从测序仪中获得更多数据[创新技巧]

随着DNA测序仪器的成本急剧下降，越来越多的实验室对这些平台更加得心应手。当然，这也使得研究人员不再满足于现有的平台。他们开始尝试打开盖子，调整机器，以满足他们的个性化需求。实际上，一些实验室已经以独特而有趣的方式改装了他们的测序仪。

下面介绍了三位这方面的高手，他们有的做了简单的调整，任何实验室都能做到；有的做了高级的修改，可能需要一定的专业知识。如果您对这方面有兴趣，也可以试试，只是千万别联系Illumina寻求技术支持:)

让测序仪产生更长的读取

Illumina测序仪通常将DNA打断成短片段，再固定到流动槽的表面。这一新方法允许研究人员将较长的DNA片段固定在流动槽的表面，在流动槽中原位开展最后的文库制备步骤，以便更经济高效地从长分子中获得序列信息。

高手：华盛顿大学的Jay Shendure实验室。Shendure实验室专注于靶向重测序方法，并寻找大的队列来了解变异。他们也对合成生物学和胎儿DNA测序感兴趣。Shendure实验室的一名生物学家Jerrod Schwartz谈道：“我们喜欢摆弄仪器，让它们做我们想做的。”

理由：较短的读取很难用于基因组拼接，而且在复杂区域的测序或结构变异分析时，也没有长读取那么好。短读取也能显示单体型变异。其他产生此类信息的方法要么很麻烦，限制在40 kb以下，要么数据质量较差。

做法：Shendure的实验室在长链DNA的末端添加接头，它们与流动槽上的接头互补。当DNA分子的一端与表面杂交时，若是无规卷曲，则另一端将与附近杂交，若在施加于流动槽的电场作用下DNA长链被拉伸，则它将在一定距离外杂交。为了让DNA长链足够短，研究小组使用了一个转座酶，它与DNA长链结合并将其切成两段。两个片段经过桥式扩增、成簇并测序。序列簇要么互相靠近（无规卷曲的DNA），要么隔着一定距离（拉伸的DNA），在放回一起后，就能得到末端配对的DNA分子读取。

困难：这种方法仍在试验之中。Schwartz表示：“我们已经处理了10 kb左右的序列，目前我们希望推广到更大的分子。”他认为这项技术非常简单，涉及到修改Illumina的文库制备，“调整管道”，并引入电场。“任何人，只要实验室有电源，都能做到。”

文章：Schwartz, J. J., C. Lee, J. B. Hiatt, A. Adey, and J. Shendure. 2012. Capturing native long-range contiguity by in situ library construction and optical sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences 109(46):18749-18754.

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蛋白质-DNA的相互作用分析

这是一种高通量测序-荧光配体相互作用的图谱分析，简称HiTS-FLIP。从根本上说，它是在Illumina流动槽上直接添加荧光标记的蛋白，以分析蛋白质-DNA的相互作用。

高手：麻省理工学院（MIT）的Chris Burge实验室。这个实验室对基因调控感兴趣，包括选择性剪接和microRNA靶定。

理由：Burge实验室的研究方向之一是RNA结合蛋白的RNA结合亲和力图谱，这是了解RNA剪接的关键。Burge谈道：“我们在午餐时讨论，除了标准的荧光标记dNTP，我们还能在测序仪中加入什么呢？然后我们想，如果能在流动槽上直接合成RNA，然后加入荧光标记的蛋白，看它们是否结合，岂不是很酷？”由于这在技术上很难实现，他们决定先尝试一种类似但没那么难的实验。

做法：首先研究小组对一个随机25个碱基的寡核苷酸文库进行测序，以获得每个簇的位置和序列。在重建双链DNA后，他们将荧光标记的DNA结合转录因子加入流动槽内并成像。转录因子以mOrange标记，并以测序仪的内置激光和照相机进行分析。所产生的图像提供了DNA簇与转录因子的结合亲和力方面的信息。与转录因子孔结合的簇发出大量荧光，而未结合的孔几乎没有信号。

每个簇的结合强度可与其序列相关联，以便得到大约1亿个不同序列的结合亲和力，这比目前其他方法的通量更高。通过测定各种不同的蛋白浓度，在单个实验中可测定每个寡核苷酸的解离常数（Kd值）。

困难：HiTS-FLIP在实施起来难度中等。改写GAII的配方是比较简单的部分，而优化条件需要一些时间。分析数据是最困难的部分，但也不需要开发全新的算法。Burge的实验室正与其他实验室合作，让这种方法更快速、更经济。此外，Burge以前的研究生Robin Friedman已改善了分析组件，因此读者可关注HiTS-FLIP 2.0。

文章：Nutiu, R., R. C. Friedman, S. Luo, I. Khrebtukova, D. Silva, R. Li, L. Zhang, G. P. Schroth, and C. B. Burge. 2011. Direct measurement of DNA affinity landscapes on a high-throughput sequencing instrument. Nature Biotechnology 29(7):659-664.

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单个通道的测序

测序仪开机一次不便宜，要凑足这么多的样品，可不是件容易的事。如果能开展单个通道的测序，那就太好了。这位高手真的做到了。他们利用Illumina Genome Analyzer II开展逐个通道的测序。

高手：麻省理工学院的BioMicroCenter，主管为Stuart Levine。BMC主要为Koch综合癌症研究所的生物学和生物工程系以及MIT环境健康科学中心的数百个实验室提供支持。

理由：目前使用最广泛的测序仪为Illumina的Genome Analyzer II和HiSeq 2000系统。这些测序仪的主要限制在于需要以相同的参数运行多通道的样品。据Levine介绍，你不能只选择运行一个或两个通道。然而，目前有很多实验只需要单通道的测序。“如果你找不到其他人来填满其他通道，那么你就没办法填满流动槽。你只能等。”

做法：每个通道都有自己的注射器，将试剂拉入通道。一个横杆贯穿所有的通道，让这一切同时流动。据Levine介绍，最简单的方法是拆下你不打算使用的通道。这使得注射器脱离。然而，这会使拉动的体积发生变化，于是研究小组需要校正死体积，也就是试剂和流动槽之间单个流动管中的体积。他们通过修改控制体积的脚本来实现这个。他说：“我们写了一个小的Python脚本，让我们能够可靠地确保我们抓住所有不同的地方。”

通过这一调整，每次可运行任意数量的通道。同一流动槽在多个测序运行中的反复使用没有明显降低运行的强度、簇密度和准确性。这些调整让带有不同设计参数的小规模实验也能在GA II上常规开展。

困难：据Levine介绍，这很难设计，需要多次试验和错误。然而，操作本身并不难开展。它不需要特殊的设备或编程知识。他还特别提醒：不要指望Illumina来帮助你。“对于仍在服务合同内的仪器，我们没有这样做，”他说。

文章：Gravina MT, Lin JH, Levine SS. Gravina, M. T., J. H. Lin, and S. S. Levine. 2013. Lane-by-lane sequencing using illumina's genome analyzer II. BioTechniques 54(5):265-269.