探索长链非编码RNA的世界 各路工具来帮忙[new]

【字体: 时间:2017年01月11日 来源:生物通

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  长链非编码RNA(lncRNA)是一个变废为宝的典型。之前,由于不编码蛋白质,这些lncRNA一直被嘲笑为“垃圾DNA”。然而,多年的研究终于为lncRNA正名,虽然不编码蛋白质,但它对基因表达还是有很大贡献的。于是,lncRNA成为生物学研究的新热点。

长链非编码RNA(lncRNA)是一个变废为宝的典型。之前,由于不编码蛋白质,这些lncRNA一直被嘲笑为“垃圾DNA”。然而,多年的研究终于为lncRNA正名,虽然不编码蛋白质,但它对基因表达还是有很大贡献的。于是,lncRNA成为生物学研究的新热点。

探索lncRNA的世界,当然需要一定的工具。所幸,lncRNA与mRNA有些相似,故标准的基因表达分析工具(如定量PCR、芯片、测序)也能派上用场。据专家介绍,唯一需要注意的就是灵敏度。美国Beckman研究所的John Rossi认为,分离和研究lncRNA不需要特殊的工具,但需要方法来检测它们,因为它们通常丰度很低。

lncRNA研究的技术路线可参照mRNA或miRNA:首先利用转录组测序(RNA-Seq)或芯片来开展lncRNA的表达谱分析,之后通过qRT-PCR或Northern blot来验证。这些主要用于lncRNA的定性或定量分析,而在功能分析中,抑制或过表达、RIP都是十分常用的工具。

芯片

对于lncRNA的表达谱分析而言,芯片是个强大的工具。目前有多家公司提供lncRNA的芯片和服务,包括Arraystar、Affymetrix、安捷伦等。

美国Arraystar公司自2009年起一直专注于lncRNA芯片的开发,如今已推出第四代产品——Arraystar Human LncRNA Microarray v4.0。它的国内代理公司为康成生物,独家提供Arraystar lncRNA芯片技术服务。到目前为止,康成客户采用Arraystar lncRNA芯片发表的SCI论文已经超过180篇,其中多篇发表在《Cancer Cell》、《Hepatology》、《Blood》等国际顶尖杂志上。

LncRNA芯片让您能够在单张芯片上同时分析lncRNA和mRNA的表达谱。这样,您不仅能够了解差异表达的lncRNA和mRNA,还能清楚它们之间的关联。与传统芯片不同,Arraystar lncRNA芯片采用了“转录本特异”的探针设计,可准确检测由一条原始转录本来源的不同RNA。它还提供了系统而实用的lncRNA注释,为深入研究其复杂功能提供参考信息。

近日,上海交通大学附属仁济医院房静远教授的课题组应用美国Arraystar公司的lncRNA芯片分析了胃癌组织的lncRNA表达情况,筛选到可预测胃癌发生的分子标志物GClnc1,并且阐明了GClnc1在胃癌的发生和发展中是如何发挥调控作用的。这项研究成果发表在著名学术期刊《Cancer Discovery》(影响因子19.783)上。

此外,Arraystar公司还最新推出了nrStar™ Human Functional LncRNA PCR Array,可同时检测372个功能已知或疾病相关的金标准lncRNA。这些lncRNA来自科学文献和最新数据库。与大部分功能未知、序列残缺的lncRNA相比,产品中的lncRNA特征明确,信息完善。

若有意了解lncRNA芯片技术服务的更多信息,请咨询康成生物。

赛默飞世尔旗下的Affymetrix也提供了转录组分析的好工具——GeneChip® Human Transcriptome Array 2.0。这款俗称HTA 2.0的芯片设计了近700万条探针,可检测超过28万条全长转录本,包括超过24万条编码转录本和超过4万条非编码转录本。为支持这一海量数据的分析,Affymetrix还开发出了TAC软件。索取HTA 2.0芯片的更多资料

2014年,我国著名的免疫学家曹雪涛院士在《Science》杂志上发表文章,探究了lncRNA在树突状细胞分化及功能中的作用。在分析中,研究人员首先利用HTA 2.0芯片来检测单核细胞分化至树突状细胞的过程中lncRNA的表达变化。之后通过层层分析,他们鉴定出一个关键的lncRNA(lnc-DC),并验证了其功能和作用机制。

安捷伦的SurePrint G3基因表达谱芯片也将编码和非编码RNA整合在单张芯片上,实现了lncRNA 和蛋白编码基因的同步检测。这是安捷伦与 John Rinn 实验室(隶属于麻省理工学院-哈佛大学Broad研究所)合作的成果。

这款8x60K的芯片在2010年首次推出,如今已升级到第2版,更好地反映了目前对lncRNA表达和结构的了解。2011年秋天,John Rinn 实验室的Moran Cabili及其同事深入研究了来自24个人类组织和细胞系的RNA-seq数据集,并鉴定出近8,200个假定lncRNA,包括4,662个严格的lncRNA。第二版的芯片正是反映了lncRNA目录的更新,同时也包含了新的mRNA探针。

SurePrint G3人类基因表达谱v2芯片具有宽广的动态范围(超过五个数量级)和极高的灵敏度,可同时检测样本中的低表达和高表达目标。安捷伦的芯片一贯灵活,充分支持研究者设计与其实验相关的各种定制芯片。


RNA-Seq

在lncRNA的发现阶段,新一代测序平台无疑是人们最得力的助手,而许多新的发现也正是来源于此。通过表达谱分析,人们可以鉴定在发育或特定情况下差异表达的lncRNA,从而揭开它们的潜在功能。或者,人们寻找表达关联的lncRNA和蛋白编码基因,了解共同调控。

2015年,加州大学洛杉矶分校的研究人员利用RNA测序来分析人类骨髓和胸腺祖细胞中的lncRNA。通过这些稀有细胞的分析,研究人员发现了3,000多个以前未知的lncRNA,让科学家对“人类免疫系统如何发展”有了一个全新的认识。这项成果发表在免疫学顶级杂志《Nature Immunology》上。

同样地,在上面提到的曹雪涛院士的研究中,研究人员也使用了新一代测序。他们用Illumina HiSeq 2000测序仪来检测树突状细胞分化时第0天和第7天的lncRNA表达情况,发现99个lncRNA差异显著。之后,他们再结合芯片的分析结果,挑选出表达倍数高的lnc-DC作为下一步的研究对象。如此可见,芯片和测序并不是处在对立面的,将两种技术相结合,结果更具说服力。

当然,并不是每个实验室都有机会用到新一代测序仪。如果没有,也可以将测序服务外包。锐博生物推出了lncRNA-Seq服务,通过基于去除核糖体RNA的建库方法以及高通量测序技术,可以得到细胞内所有RNA转录产物的序列,并通过后期的生物信息学分析,可对lncRNA进行深入的研究。咨询详情

Northern blot和qPCR

Northern blot和qPCR分析不仅可用于分析lncRNA的表达水平,也常用于验证芯片或测序的结果。此外,目前也有人利用荧光原位杂交(FISH)技术来检测和定位细胞中特定的lncRNA。

提到qPCR的分析,我们当然不能忘了金标准的TaqMan Assay。TaqMan® Non-coding RNA Assays是基于久经考验的TaqMan®分析技术,借助现有TaqMan® Gene Expression Assay的设计渠道来生成分析,以便准确检测非编码RNA靶点。据介绍,赛默飞世尔科技提供近25,000个TaqMan Assay,特异针对人、小鼠和大鼠的lncRNA目标。

赛默飞在lncRNA分析的整个流程提供了丰富的产品,从RNA分离到逆转录,从qPCR到数据分析,详见下图。欢迎索取详细资料。

lncRNA的功能分析

就lncRNA的功能分析而言,siRNA是大家常用的工具。不过,Exiqon公司还提供了一种更先进的工具。LNA™ GapmeR是一类能高效抑制mRNA和lncRNA功能的反义寡核苷酸,可用于mRNA和lncRNA的功能分析。它的结构中间为一段DNA分子,两侧是经LNA修饰的核苷酸区。这种区域的设计增加了寡核苷酸与靶标的亲和性及其本身对核酸酶降解作用的抵抗性,而中间DNA gap结构的作用却恰恰相反,它激发了RNase H的活性,在DNA与靶RNA结合的部位进行剪切。

除了抑制或过表达的分析,人们也常常使用RNA结合蛋白质免疫沉淀技术(RIP)来分析lncRNA的互作蛋白。默克集团生命科学部则提供了多款试剂盒,可分析各种与染色质相关的RNA,如lncRNA和miRNA。Nuclear RIP试剂盒可分析经过甲醛处理(交联)或未经过处理(天然)的相互作用。这两种方法在原理上类似,但所用试剂和操作方案不同。交联法可捕获分子量较高的复合物,而天然法倾向于回收亲和力高且更直接的相互作用。对于不太熟悉的蛋白质,通常使用两种方法。立即索取详细资料

除RIP以外,CLIP也可以帮助人们捕捉与RNA结合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交联与核酸酶消化,不仅允许对RNA-蛋白复合物进行进一步的纯化(如凝胶电泳片段分离),还能够揭示RNA-蛋白互作所发生的位点。最近人们又开发出了新型CLIP 技术——iCLIP(individual-nucleotide resolution CLIP),这项技术能够以单个碱基的分辨率,来展示RNA-蛋白互作的详细信息。

lncRNA这个全新的世界正等待着我们去探索。尽管我们对它的了解有限,工具也有限,但正是如此,才有可能抢先占领制高点,发表漂亮的文章。(生物通 余亮)

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