miRNA研究如何克服样本量的限制[新品推荐]

【字体: 时间:2013年07月10日 来源:生物通

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  qRT-PCR这种经典技术是miRNA表达谱分析的首选方法。然而,对于某些样本,如分选后的细胞、激光捕获组织、循环肿瘤细胞,样本量有限,未必能开展miRNome分析。在此,我们就介绍一个基于PCR的系统,它能将miRNome分析所需的样本量降低了几个数量级,同时带来了出色的重复性和精确性。

microRNA(miRNA)虽只有短短22个核苷酸,但在细胞分化和发育中的作用却不容小觑。在许多生物学过程中,miRNA都扮演了重要角色。因miRNA稳定性高并具有组织特异性,人们对其临床应用的兴趣日益增加。此外,血液中循环miRNA的发现更是刺激了大量研究,希望能找到特定疾病的生物标志物。

对于生物标志物的发现而言,整个miRNA组(miRNome)表达谱的绘制往往是这些研究中最基本的一环,可通过多种方式实现,包括芯片、RNA-seq和qRT-PCR。当然,每一种方式都有其优势和限制。芯片杂交需要微克级的RNA,且灵敏度和动态范围有限。细胞中miRNA表达的范围往往超出了芯片的动态范围,因此相当一部分miRNA无法检测。而且,芯片只能检测已知miRNA,不能发现新的miRNA。

一提起miRNA的发现,新一代测序就笑了。RNA-seq这种新技术最适合发现,可鉴定SNP、突变和新的miRNA。RNA-seq通常被视为一种筛查技术。就目前而言,它以一种半定量但极透彻的方式鉴定样本中的所有序列。当然,它价格不菲,数据分析繁复,并非全部实验室都有机会使用。

qRT-PCR这种经典技术仍然是miRNA表达谱分析的首选方法,因为它符合您的所有期望:样本量低、灵敏度高、特异性好以及动态范围广。在单次运行中,从10到107个拷贝的miRNA靶标都能准确定量。一般而言,每次分析需要1 ng总RNA,而miRNome的分析需要1 μg RNA。对于细胞系的分析,这点RNA当然是小菜一碟,但并非所有研究都那么幸运。分选后的细胞、激光捕获组织、循环肿瘤细胞如此珍贵,未必能实现。在此,我们就介绍一个基于PCR的系统,它能将miRNome分析所需的样本量降低了几个数量级,同时带来了出色的重复性和精确性。

miRNA的预扩增

这就是来自QIAGEN的miScript® PreAmp Primer Mixes 。尽管市场上也有一些方法能预扩增miRNA,但miScript PCR System是唯一一种技术,包含了真正通用、小RNA特异的cDNA合成反应。

在这种专利技术中,miRNA被大肠杆菌poly A聚合酶加尾,接着以oligo dT为引物合成cDNA。这确保了所有miRNA都能无偏向地转化成cDNA。更重要的是,这包括了过去未曾鉴定的miRNA,让您在发现了新的miRNA靶标时能随时返回到原先保存的cDNA样本。在此,RNA的用量不是很关键,但QIAGEN建议cDNA合成反应包含10 ng RNA(相当于300个细胞)。每个cDNA合成反应可用于10次预扩增反应,每次1 μl(相当于1 ng RNA或30个细胞)。更多RNA当然也可以,但没有必要。更少RNA也并非不行,但若少于3个细胞,取样的差异会导致中等或低表达miRNA的结果发生变化。

预扩增过程是一个高度多重的PCR,以96或384个分析的形式开展,这对应了QIAGEN预开发的96-和384-分析的miScript miRNA PCR Array。经过12个循环的预扩增,其产物可与实时定量PCR预混液混合,用于miRNA表达谱分析。无论是10-20个拷贝的靶标,还是107个拷贝的靶标,如今都增长了4个数量级。这下,您再也不用担心样本量不够了。FFPE组织,血液、尿液等体液都能采用这种办法预扩增。

样本量是够了,但预扩增会不会影响miRNA表达谱本身呢?相信这是大家最关心的问题。如此大量分析的同时开展,确实是个难题,但QIAGEN通过一些设计特征使其成为可能。首先,由于miScript PCR System采用通用的3’ PCR引物,预扩增引物库的复杂度立即下降50%。其次,所有的扩增子都有着相同的大小和非常接近的Tm,这大大有利于多重反应的无偏向扩增。最后,cDNA合成反应的试剂严重限制了cDNA副反应,这样背景cDNA极少,而预扩增反应中的背景也极低。

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口说无凭,数据奉上。研究人员对5 μm的FFPE切片进行了miRNA表达谱分析,发现预扩增保留了样本中的表达模式。

   

图1. 预扩增保留了FFPE样本中的表达模式。来自同一次制备的预扩增和未预扩增cDNA用于miRNA图谱分析。散点图证明了这两组样本之间的高度关联。标准化是利用看家对照开展的。研究中使用了A. 96-plex miFinder miScript PreAMP Pathway Primer Mix & Array或B. 384-plex miScript PreAMP miRNome Primer Mix & Array。

FFPE样本的预扩增策略

福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的组织样本为癌症研究提供了一个非常宝贵的信息库。经miRNeasy FFPE Kit纯化后,5 μm的切片也能产生足够的RNA,用于miRNome分析。然而,对于细针穿刺活检样本等珍贵样本,远远达不到这个量,怎么办?据QIAGEN专家介绍,从邻近切片上获得的图谱分析数据也极为相似,只要细胞类型和数量相似(图2)。然而,由于固定和保存的变化,还是需要仔细的标准化。这可以通过对不变的miRNA或snoRNA标准化或通过对表达的miRNA靶标的平均值标准化来实现。

图2. 邻近FFPE切片提供了一致的表达模式。来源于同一个样本的3个不同FFPE切片的cDNA被用于miRNA图谱分析。对于样本之间的所有分析,CT值高度一致。

体液的预扩增策略

血清和血浆中相对稳定的无细胞(cell-free)miRNA的存在引发了极大的兴趣,因为这些miRNA水平的改变有可能作为多种疾病的生物标志物。一般情况下,通过qRT-PCR进行miRNA图谱分析只需要20 μl血清或血浆。如果样本量充足,QIAGEN建议在每次RNA制备时使用100-200 μl。然而,若样本很宝贵,则最好开展预扩增反应,以降低样本量。例如,在miScript PCR System的预扩增之后,大约1 μl血清即可开展整个miRNome的分析。除了降低样本量,预扩增还能使检测到的miRNA大大增加。类似地,全血,如1 μl血斑,也能开展miRNA表达谱的分析,且成功率很高。

一些细胞外的循环miRNA似乎限制在外泌体(exosome)内。外泌体的富集通常需要超速离心步骤来沉淀外泌体。这种沉淀物可通过miRNeasy Serum/Plasma Kit处理。目前也有一些富集外泌体的替代方法,但这些方法的重复性尚未确定。虽然如此,在通过聚合物沉淀、免疫捕获或其他方法纯化外泌体之后,可利用miRNeasy Micro Kit和miRNeasy Serum/Plasma Kit来分离RNA。

尿液也有望用于生物标志物的发现,尤其是对肾脏和前列腺疾病。从200 μl尿液回收的miRNA通常不够一块96或384重PCR芯片的分析。更大样本的处理会提高RNA产量,但也会增加样本中存在的抑制剂。对于细胞miRNA的分析,细胞和碎片应沉淀,并利用miRNeasy Micro Kit来纯化。对于尿液中无细胞miRNA的分析,QIAGEN建议先通过离心或过滤来去除细胞和细胞碎片。之后利用miRNeasy Serum/Plasma Ki处理100-200 μl尿液,用1.4 μl洗脱液合成cDNA,并用1 μl cDNA合成反应来进行预扩增。

QIAGEN也对其他体液开展了研究,包括脑脊髓液、乳汁、支气管灌洗液等。他们的经验是,RNA产量取决于样本是来自健康还是患病样本,以及样本中细胞内容物的程度。对于外泌体和细胞外RNA,总是需要离心来去除细胞和细胞碎片。

无细胞miRNA的标准化对照

大家都知道,实验的对照必不可少。在miRNA表达分析中,小的非编码RNA(如snRNA和snoRNA)常用于数据的标准化。然而,这些RNA在血清和血浆中不表达,因此,我们有必要寻找另一种标准化方法作为替代。QIAGEN的专家建议,在RNA纯化之前向样本中添加合成的RNA。随后可检测到这种加标的RNA,这一数据也可用于纯化过程中回收差异和扩增效率差异的标准化。QIAGEN的miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control正适合此用途。这种合成的RNA可在预扩增步骤中扩增,且miRNeasy Serum/Plasma Kit和miScript miRNA QC PCR Array也提供了检测此RNA的分析。

在校准化了RNA回收差异之后,普遍表达靶标的整体CT平均值(适用于miRNome和通路表达分析)和不变miRNA的CT平均值(适用于小型表达分析)可用于qRT-PCR数据的标准化。

结语

的确,miRNA的生物标志物发现面临重大挑战,不仅样本量低,其RNA含量也有限。同时,发现过程需要筛查大量的miRNA,并重复多次。此时,miRNA的预扩增可解决这些问题。再加上专用于miRNA纯化的miRNeasy试剂盒,这实现了完整的miRNA生物标志物发现实验。预扩增让研究人员能发现之前无法获得的miRNA表达数据。这无疑会让miRNA的研究更上一层楼,从而更深入了解这些小分子在疾病和细胞中的作用,并让miRNA表达谱真正应用在诊断和药物开发中。(生物通 余亮)

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