如何优化您的电穿孔实验?[心得点评]

【字体: 时间:2013年08月30日 来源:生物通

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  有时候即使严格按照实验流程来操作,也没有得到预期的结果。这时,别忙着将目的基因克隆到腺病毒或慢病毒上,我们还可以优化和调整电穿孔实验。优化可从几方面下手:制备细胞和DNA的方法,电穿孔本身,以及之后如何处理细胞。各路专家就此提出了他们的建议。

一些细胞,如HeLa细胞,很容易用脂质体转染。而其他细胞,如干细胞、原代神经元和未受刺激的T细胞和B细胞,则没那么简单。对于这些细胞而言,电穿孔逐渐成为首选方法,而研究人员也会采取更复杂的方法作为备份,如病毒转导。

据NEPA21系统的北美经销商Mike Mortillaro介绍,在过去,电穿孔仪提供单一的大幅电脉冲来打开细胞,让外来物质通过布朗运动而扩散进去。这个过程很剧烈,往往留下很多死细胞,比已转染的细胞还多。如今许多精密的系统可以改变电击的参数,效率更高,对细胞的伤害也更小。

然而,有时候即使严格按照实验流程来操作,也没有得到预期的结果。这时,别忙着将目的基因克隆到腺病毒或慢病毒上,我们还可以优化和调整电穿孔实验。优化可从几方面下手:制备细胞和DNA的方法,电穿孔本身,以及之后如何处理细胞。各路专家就此提出了他们的建议。

培养条件

细胞应该是健康的,没有支原体。问题可能在于细胞在制备过程中受到损伤,而施加电脉冲只会让情况更加恶化。Lonza的高级产品经理Andrea Toell认为,有时只需降低离心速度,就能改善结果。Lonza是Amaxa Nucleofector™系统的制造商。

Bio-Rad公司细胞生物学部门的研发经理Teresa Rubio则提出,一些酶的使用,如胰酶,有时也会对电穿孔产生不利影响。同时,当您开展任何一种转染时,去除抗生素也很重要,之后可继续使用。

在处理培养的细胞时,它们最好处于对数生长期,MaxCyte的技术应用总监Jim Brady如是说。DNA更容易进入积极分裂的细胞。这也是原代、不分裂的细胞很难转染的原因之一。

然而,即使是这些不分裂的细胞,只要操作一致,也会有好的结果。Life Technologies研发部门高级经理Kristin Wiederholt谈道,研究人员常常抱怨电穿孔的转染效率不稳定,其实很多因素往往不一致,例如细胞如何被破坏,电穿孔后多久铺板。她建议优化那些步骤,同时锁定单个参数。

按照类似的思路,Toell认为,如果原代人类T细胞转染不顺利,那也许是在于细胞的供体。因此,我们可以再试一次,采用另一位供体,看是不是有所改善。细胞系在多代之后会改变其属性,因此,若转染效率不符合预期,则应该考虑一下从ATCC买个新鲜的。

电击

与脂质体转染相比,电穿孔有其独特的优势,脉冲不仅能在外膜上开孔,也能在核膜上产生缺口。

现代的电穿孔仪能够控制脉冲的持续时间、幅度(电压)、数量,甚至是极性和波形。例如,Life Technologies的Neon、Bio-Rad的Gene Pulser和NEPA21系统都是开放的系统,让用户能够单独控制每个参数。制造商通常也有一个数据库,提供特定细胞类型的建议设置,您可在这个基础上优化和调整。

其他系统,包括MaxCyte和Amaxa Nucleofector,则被认为是黑匣子。根据该公司的优化数据库,用户得到了特定细胞类型的代码。它编码的各个参数,以及缓冲液的组成,仍然是个秘密。Brady解释道:“如何提供电流非常关键。使用错误的参数会导致细胞死亡。除非你是个生物物理学方面的专家,否则你真的不知道如何玩转那些不同的变量。”如果结果不符合预期,您可以致电技术支持,他们将提供故障排查的协助,或者尝试另一种代码。

当然,一定要使用对照。在致电技术支持时,第一个问题可能是:厂家提供的对照质粒结果如何?如果不好,那问题可能出在DNA。一些厂家建议使用QIAGEN的EndoFree或类似的无内毒素DNA制备试剂盒。Toell认为,质粒上的内部核糖体进入位点(IRES)序列和长的重复可能也有不利影响。

DNA是客户需要优化的唯一东西。Brady谈道:“大量DNA将带来高的转染效率,但也会降低细胞活性,因为大量DNA对细胞而言是有毒的。”同样,包含多个基因的大质粒(如iPS细胞重编程中使用的那些)也会使效率降低。Wiederholt建议使用多个、较小的质粒。

转染之后

细胞在转染之后被如何处理也会有影响,例如它们被放入何种培养基中,铺板的密度如何,甚至孵育温度如何。Mortillaro建议尽快将细胞放回去培养,“越早放回去,它们会越健康,细胞活力也更好”。

细胞活力和转染效率通常在转染后24小时测定,让细胞有时间恢复,并表达蛋白。

如果经过一切优化和调整,表达目的蛋白的健康细胞数量仍达不到您的要求,那么试试RNA。它不需要进入细胞核就能表达,因此,当DNA转染失败时,mRNA或siRNA转染有时却能成功。

欢迎索取Life Tech Neon系统的更多资料

(Josh P. Roberts / 薄荷编译)

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