如何优化您的电穿孔实验？[心得点评]

一些细胞，如HeLa细胞，很容易用脂质体转染。而其他细胞，如干细胞、原代神经元和未受刺激的T细胞和B细胞，则没那么简单。对于这些细胞而言，电穿孔逐渐成为首选方法，而研究人员也会采取更复杂的方法作为备份，如病毒转导。

据NEPA21系统的北美经销商Mike Mortillaro介绍，在过去，电穿孔仪提供单一的大幅电脉冲来打开细胞，让外来物质通过布朗运动而扩散进去。这个过程很剧烈，往往留下很多死细胞，比已转染的细胞还多。如今许多精密的系统可以改变电击的参数，效率更高，对细胞的伤害也更小。

然而，有时候即使严格按照实验流程来操作，也没有得到预期的结果。这时，别忙着将目的基因克隆到腺病毒或慢病毒上，我们还可以优化和调整电穿孔实验。优化可从几方面下手：制备细胞和DNA的方法，电穿孔本身，以及之后如何处理细胞。各路专家就此提出了他们的建议。

培养条件

细胞应该是健康的，没有支原体。问题可能在于细胞在制备过程中受到损伤，而施加电脉冲只会让情况更加恶化。Lonza的高级产品经理Andrea Toell认为，有时只需降低离心速度，就能改善结果。Lonza是Amaxa Nucleofector™系统的制造商。

Bio-Rad公司细胞生物学部门的研发经理Teresa Rubio则提出，一些酶的使用，如胰酶，有时也会对电穿孔产生不利影响。同时，当您开展任何一种转染时，去除抗生素也很重要，之后可继续使用。

在处理培养的细胞时，它们最好处于对数生长期，MaxCyte的技术应用总监Jim Brady如是说。DNA更容易进入积极分裂的细胞。这也是原代、不分裂的细胞很难转染的原因之一。

然而，即使是这些不分裂的细胞，只要操作一致，也会有好的结果。Life Technologies研发部门高级经理Kristin Wiederholt谈道，研究人员常常抱怨电穿孔的转染效率不稳定，其实很多因素往往不一致，例如细胞如何被破坏，电穿孔后多久铺板。她建议优化那些步骤，同时锁定单个参数。

按照类似的思路，Toell认为，如果原代人类T细胞转染不顺利，那也许是在于细胞的供体。因此，我们可以再试一次，采用另一位供体，看是不是有所改善。细胞系在多代之后会改变其属性，因此，若转染效率不符合预期，则应该考虑一下从ATCC买个新鲜的。

电击

与脂质体转染相比，电穿孔有其独特的优势，脉冲不仅能在外膜上开孔，也能在核膜上产生缺口。

现代的电穿孔仪能够控制脉冲的持续时间、幅度（电压）、数量，甚至是极性和波形。例如，Life Technologies的Neon、Bio-Rad的Gene Pulser和NEPA21系统都是开放的系统，让用户能够单独控制每个参数。制造商通常也有一个数据库，提供特定细胞类型的建议设置，您可在这个基础上优化和调整。

其他系统，包括MaxCyte和Amaxa Nucleofector，则被认为是黑匣子。根据该公司的优化数据库，用户得到了特定细胞类型的代码。它编码的各个参数，以及缓冲液的组成，仍然是个秘密。Brady解释道：“如何提供电流非常关键。使用错误的参数会导致细胞死亡。除非你是个生物物理学方面的专家，否则你真的不知道如何玩转那些不同的变量。”如果结果不符合预期，您可以致电技术支持，他们将提供故障排查的协助，或者尝试另一种代码。

当然，一定要使用对照。在致电技术支持时，第一个问题可能是：厂家提供的对照质粒结果如何？如果不好，那问题可能出在DNA。一些厂家建议使用QIAGEN的EndoFree或类似的无内毒素DNA制备试剂盒。Toell认为，质粒上的内部核糖体进入位点（IRES）序列和长的重复可能也有不利影响。

DNA是客户需要优化的唯一东西。Brady谈道：“大量DNA将带来高的转染效率，但也会降低细胞活性，因为大量DNA对细胞而言是有毒的。”同样，包含多个基因的大质粒（如iPS细胞重编程中使用的那些）也会使效率降低。Wiederholt建议使用多个、较小的质粒。

转染之后

细胞在转染之后被如何处理也会有影响，例如它们被放入何种培养基中，铺板的密度如何，甚至孵育温度如何。Mortillaro建议尽快将细胞放回去培养，“越早放回去，它们会越健康，细胞活力也更好”。

细胞活力和转染效率通常在转染后24小时测定，让细胞有时间恢复，并表达蛋白。

如果经过一切优化和调整，表达目的蛋白的健康细胞数量仍达不到您的要求，那么试试RNA。它不需要进入细胞核就能表达，因此，当DNA转染失败时，mRNA或siRNA转染有时却能成功。

欢迎索取Life Tech Neon系统的更多资料

（Josh P. Roberts / 薄荷编译）