让我们轻松揭开exosome的秘密[新品推荐]

【字体: 时间:2013年09月11日 来源:生物通

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  exosome是一种直径约为30-150 nm的小囊泡。它们不仅由所有培养的细胞所分泌,还天然存在于各种体液中,参与细胞间通讯,或支持或干扰不同的生理过程。对于这一新兴的研究热点,生物通在这里为您推荐一系列全新的标准化研究工具,让您可以将更多精力专注于exosome通路和生物学功能的研究上。

大家都知道,细胞不断向细胞外空间分泌大量的小囊泡、大分子复合物及小分子。在这些小囊泡中,有一种正受到广泛的关注,这就是exosome。exosome的直径约为30-150 nm。它就像一辆小卡车,运载货物穿梭于身体的不同部位之间。

小卡车上到底装了什么?大家都想了解。很多年来,人们一直以为只有一些垃圾袋,让细胞丢弃不必要的蛋白。然而,如今看来却并非如此,exosome也携带了一些重要的信号分子,如miRNA、ncRNA、mRNA等,至少在某种程度上实现了细胞间的通讯。因此,小小的exosome似乎有着重要的功能,也有着大大的临床应用前景。

从被遗忘到被重视

exosome的发现要追溯到30年前。研究人员陆续发现大鼠网织红细胞、绵羊红细胞等分泌小囊泡。在分离了这些小囊泡之后,他们发现了多种有活性的酶。至此,exosome的蛋白运输功能被研究界所接受,然而,之后exosome似乎完全被人遗忘。直到2007年,研究人员发现了RNA运输功能,exosome才重新成为人们关注的对象。

exosome不仅由所有培养的细胞所分泌,还天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液和母乳。无论是细胞分泌到培养基中的exosome,还是各种器官分泌到体液中的exosome,都参与了细胞间通讯,或支持或干扰不同的生理过程。

早期的研究发现,exosome能够特异靶定受体细胞,交换蛋白和脂类或引发下游信号事件。这种小囊泡参与了多个过程:免疫反应的促进剂、抗原呈递、程序性细胞死亡、血管生成、炎症和凝血等。此外,它还参与了发育和分化。

不仅如此,这辆小卡车还运载了特异的核酸货物,参与了细胞间通讯。Valadi等发现,MC/9和人肥大细胞系分泌的exosome包含了来自约1300个基因的mRNA以及小RNA,包括121个microRNA。这项成果犹如一枚重磅炸弹,在研究界引起轰动。

于是乎,人们对exosome的兴趣激增,从它们在体内的功能到更为实际的应用 – 诊断和治疗方法的开发。据统计,目前已有1500多篇有关exosome的文章发表,其中大部分是在近3年内发表的,而国际细胞外囊泡协会(ISEV)于去年成立,更是立即吸引了700多名会员加入。

鉴于所有体液中都包含exosome,且其蛋白、RNA和脂肪成分特异,exosome有望在多种疾病的早期诊断中发挥作用。与传统的活检相比,微创(抽血)或无创(使用尿液或唾液)诊断方法减少了患者的痛苦和不便,也降低了分析成本。近两年,多个研究团队对血液、尿液和唾液中的exosome进行研究,发现了多种疾病的生物标志物,有望指导疾病的个性化治疗。

exosome的研究该如何下手

阅读至此,相信大家都已经跃跃欲试了吧。不过,exosome的研究该如何下手呢?首先自然是从细胞培养基或体液中分离出总exosome,亚群的分离检测;接着是回收里面的RNA或者蛋白质货物;再通过qRT-PCR等方法进行深入的功能分析。新的研究方向虽容易发表文章,也面临着更大的挑战,因为研究方法还不成熟,市售工具相当少,可能需要花费大量时间去开山辟路优化方法。生物通在这里为您推荐一系列全新的标准化研究工具,让您可以将更多精力专注于exosome通路和生物学功能的研究上。

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exosome的分离

早前发表的一些研究主要是从淋巴细胞、胚胎干细胞以及血清、唾液和母乳中提取出exosome并回收RNA,再利用qRT-PCR和新一代测序来进行鉴定和分析。它们在分离时往往是采用超速离心的方法。这的确是一种经典的方法,能制备出干净的exosome。但是,缺点也不少:耗时耗力,往往需要8-30个小时;每次最多只能处理6个样品;需要大量的起始材料;产量不高。最重要的是,你得有台超速离心机,还要有丰富的经验。

如果有个试剂盒,像提质粒那样轻松地提取出exosome,那就再好不过了。幸好,这样的试剂盒已经上市。Life Technologies公司旗下Invitrogen品牌推出了多款总exosome提取试剂盒,能分别从细胞培养基、血清、血浆、尿液及其他体液中分离完整的exosome。与超速离心相比,这种方法实在是简单省事多了。

这种试剂通过捆绑水分子,将溶解度不太高的组分(如囊泡)挤出溶液,从而可通过常规离心来收集。样品先经过2000xg 30分钟低速离心以去除细胞碎片,根据样品类型加入指定比例的提取试剂并混匀,并在2-8°C孵育一定时间(血清样品只需4度孵育30分钟,培养基上清则需孵育过夜),然后通过常规离心(10,000 x g,10-60分钟,因样品类型而异)即可回收exosome沉淀。其中手动操作部分仅需15-20分钟,甚至比提质粒还简单。之后用PBS或类似溶液重新溶解沉淀。这下,exosome可立即用于下游分析或进一步的纯化啦。

Life Tech的平行比较试验结果显示,试剂法与超速离心法提取出的exosome相当。在NanoSight® LM10仪器上分析的图谱显示,所有囊泡均小于300 nm,且大部分处于exosome的典型大小范围30-150 nm(图1)。

图1. 从HeLa细胞培养基中回收的Exosome的分析。(A) 采用总Exosome提取(从细胞培养基中)回收的Exosome的大小分布与 (B) 采用传统的蔗糖密度梯度超速离心实验方案提取的Exosome相当。

分离亚群

在获得了总的exosome之后,您还可以通过磁珠提取出高纯度的亚群。例如Dynabeads®磁珠可捕获表达CD63的exosome,用于下游的流式细胞仪、电镜或Western blotting分析。超顺磁的Dynabeads呈浅棕色,因此在整个操作过程中您都可以“查看”您的样品。此外,样品量和磁珠量也能轻松调整。当然,您也可以不选CD63,而通过生物素化的抗体和链霉亲和素试剂来富集您感兴趣的亚群。

完整exosome的分析

分离过程结束后,您可能想要观察和确认一下这些小囊泡。不过,exosome的观察还真不简单,因为它们太小了。目前,研究人员多借助以下工具和方法。

在收集到exosome之后,我们可利用NanoSight® 仪器来分析囊泡的大小范围和浓度。这款仪器根据Stokes-Einstein 原理,将每一个进行布朗运动的颗粒直径计算出来。它既提供直接实时的纳米颗粒观察,也给出全面的颗粒粒径分布分析。

若没有NanoSight,那也没关系。通过RNA或膜组分的标记,我们也能在显微镜下观察exosome。Life Tech还提供了专门的Exosome离心柱(MW 3000),能够快速去除未掺入的染料。同时,这些离心柱也能用于缓冲液交换,或去除低分子量的杂质,如盐、核苷酸和小的寡核苷酸。此外,经过Dynabeads®磁珠富集的亚群可直接用于电镜和流式细胞仪(图2)。

图2. 利用流式细胞仪观察CD63+ Exosome。Exosome结合至包被有CD63(A和B)的乳胶微球或包被有生物素化的CD63(C和D)的Dynabeads® 链霉亲和素上,并进行CD63-PE染色。FSC/SSC (1,500次)和荧光直方图如图所示。

exosome货物的分离与分析

核酸与蛋白的分析对于许多研究人员来说已经是驾轻就熟了。Life Tech的总Exosome RNA和蛋白分离试剂盒能够从同一样品中分离蛋白和总RNA。试剂盒的标准化操作为实验带来可重复的结果。此外,您也可以通过Exosome免疫沉淀试剂盒,借助Dynabeads®磁分离技术来温和地分离出完整的exosome蛋白复合物。

这之后,就等你大显身手了。无论是利用Western blot来分析exosome蛋白,或是利用qRT-PCR或RNA-seq来分析RNA,exosome这种信号传导的新途径无疑将为您揭开一个新的研究篇章。

exosome这些迷人的小卡车,每天兢兢业业地在细胞之间穿梭,传递着重要的讯息。尽管这还是个年轻的研究领域,但有了不断上市的新工具,相信我们对exosome的了解会更加深入,更多exosome的秘密将会揭开。

如果您有兴趣了解exosome研究方面的最新进展,欢迎加入Life Tech的在线培训资源。您也可以登陆exosome的技术论坛:Exosomestalk(http://exosomestalk.com/),交流exosome相关的信息,提交自己的疑问。Life Tech的“exosome之家”页面也列出了所有相关产品信息,供您查看。(生物通 余亮)

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参考文献

1. Vlassov AV, Magdaleno S, Setterquist R, Conrad R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim Biophys Acta. 2012 Jul;1820(7):940-8.

2. Zeringer E, Li M, Barta T, et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 2013 March 26; 3(1): 11-18.

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