Nature新成果：ddPCR技术助力定量miRNA

来自Bio-Rad公司，Fred Hutchinson癌症研究中心等处的研究人员证明了液滴数字PCR（ Droplet Digital PCR，ddPCR）技术能用于不同情况下，准确，可重复性的血浆和血清microRNA（miRNA）量化检测，这将为miRNA及其它核酸作为循环系统生物标志物的应用铺垫了道路。

　　生物通报道：来自Bio-Rad公司，Fred Hutchinson癌症研究中心等处的研究人员发表了题为“Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR”的文章，证明了液滴数字PCR（ Droplet Digital PCR，ddPCR）技术能用于不同情况下，准确，可重复性的血浆和血清microRNA（miRNA）量化检测，这将为miRNA及其它核酸用于循环生物标志物的应用铺垫了道路。

这一研究成果公布在9月1日的Nature Methods杂志上，文章的第一作者，Fred Hutchinson癌症研究中心人类生物学部Muneesh Tewari博士表示，“在循环系统miRNA诊断领域，液滴数字PCR（ddPCR）能帮助我们进行生物标记物研究，直接比较同一实验室跨天多次试验，甚至不同实验室之间的检测结果。”

miRNA定量研究的挑战

miRNAs是一种小分子调控RNA，具有许多不同的细胞功能。人类基因组编码超过1,000个miRNA，这些小分子可以靶向哺乳动物基因中大约60%的基因。由于miRNAs在许多细胞类型中都富集，而且高度稳定，因此它们也许能为我们提供有关疾病进程的一些直接信息，也正是由于这个原因，不少实验室正在积极展开癌症和其它疾病中miRNA血液生物标志物的研究。

实时定量PCR（qPCR）已被广泛用于血液样品miRNA的分析测试中。但是研究人员发现，血清或血浆中的miRNA qPCR测量出现了极高的差异性，无法用作稳定的血液生物标志物的检测标准，因此这一领域的研究人员一直在寻求一种能获得更可靠结果的新方法。

利用ddPCR技术进行miRNA检测的优势

数字PCR具有许多优于定量PCR的优点，比如无需标准曲线，以及不受不同样品和试验过程中PCR扩增效率变化的影响，就能获得绝对定量。而这些优点都体现在了Bio-Rad公司推出的这款 QX100™ Droplet Digital PCR (ddPCR™) 系统中。

这一系统于2011年推出，不仅实现极高的检测灵敏度，而且还避免了使用患者特异的PCR引物所带来的扩增效率差异。

Tewari博士说，“我们选择使用Bio-Rad公司的QX100液滴数字PCR系统，因为它是目前市场上的第一个从成本和通量上考虑，适合于实验室日常研究的数字PCR系统。”

为了评估每个工作流程的步骤，包括连续稀释准备，反转录（ RT ）和PCR扩增，Tewari博士和他的团队分别在三个独立工作日中，通过ddPCR嵌套分析对比定量PCR，对水和血浆中6种不同的合成miRNA各稀释系列的cDNA进行分析，结果发现比较于qPCR，ddPCR在PCR特异性变化方面，具有更高的精确度（48-72%的更少变异系数）。

接下来，研究小组进行血清miRNA的qPCR和ddPCR并列比较检测。他们收集了20例晚期前列腺癌患者，和20例年龄相匹配的男性对照血清样品，分析其中的miR-141丰度，miR-141是一种已被证明的晚期前列腺癌的生物标志物。

研究人员分别在不同的三天里准备了qPCR和ddPCR分析的不同稀释浓度，并进行了检测，结果发现ddPCR相比于qPCR，能提高7倍不同一天里实验室的重复率，这在对照研究中也得到了证实：ddPCR的结果更为可信(p=0.0036 vs. p=0.1199)。

“液滴数字PCR将能帮助我们更加精确的追踪病人治疗期间不同时间段中的血清microRNA生物标志物浓度变化情况，这对于实时PCR来说，有时是不可能实现的，“他说。

咨询Bio-Rad，最新QX100 PCR系统技术资料>> >>

 

（生物通：张迪）

原文摘要：

Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR

Nanoliter-sized droplet technology paired with digital PCR (ddPCR) holds promise for highly precise, absolute nucleic acid quantification. Our comparison of microRNA quantification by ddPCR and real-time PCR revealed greater precision (coefficients of variation decreased 37–86%) and improved day-to-day reproducibility (by a factor of seven) of ddPCR but with comparable sensitivity. When we applied ddPCR to serum microRNA biomarker analysis, this translated to superior diagnostic performance for identifying individuals with cancer.