NanoDrop在蛋白检测中的应用专题2[创新技巧]

蛋白检测的最佳操作

**的样本保留技术使得Thermo公司的NanoDrop超微量紫外可见及荧光分光光度计可以进行众多分子的微量检测，其中就包括蛋白质的相关检测。由于蛋白质本身的特性及蛋白质溶剂的表面张力特性，微量蛋白样本的测定需要进行特殊的操作。

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以下建议能够确保你检测蛋白质样品时可以有更好的准确性和重复性：

• 进行蛋白质微量检测时，请使用2ul上样；

• 蛋白进行测定前请确保样本已混匀；
进行蛋白微量检测时，为了避免检测误差，将样本混匀是十分重要的。在进行实验前，非常需要进行彻底地、温柔地样本混匀，之后再进行样本的稀释等实验操作。另外，需要尽量避免混合液体和移液的过程中产生气泡。

• 使用低样本残留的枪头
每检测一个样本就请更换一次枪头，并在加样本溶液时让枪头触到检测基座表面，通过这种方式防止蛋白溶液残留在枪头的外侧。并且，上样时尽量不要将样本溶液全部排出，这样可以有效防止液体飞溅或基座上的样本产生气泡。

• 检测前确保基座干净并进行校正
蛋白质黏附性较强，因此在进行蛋白样本检测前，需要对基座进行清洗，去除基座上残留的蛋白等杂质，若有条件，可以对仪器进行校正检测，这样可以更好的保证测定结果的准确性。更多详情请参考NanoDrop的仪器使用说明书。

• 溶解蛋白质的缓冲液不能含有在目标光吸收波长处有强吸收的成分
芳香族氨基酸残基在280nm处有吸收，而含有芳香族氨基酸的蛋白质和多肽，即可据此直接采用吸收光检测的方法进行浓度测定。若是肽链的一级结构中不含有芳香族氨基酸，则其浓度可以通过检测205nm处的肽键的吸收值来进行计算（仅NanoDrop 2000/2000c型号）。因此，为了获得更加准确的结果，需要避免缓冲液中含有在这些波长下有强吸收的成分。下面两张光谱图显示了纯化的蛋白质和多肽的典型吸收光谱。

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上面显示的光谱图是蛋白提取纯化中常用的试剂，分别以水作为空白而得到的一系列图谱。可以通过透析或色谱柱的方法去除含有强光吸收的溶剂来改变缓冲液。使用水作为空白对照，就可以检验缓冲液的光吸收情况。另外，蛋白浓度测定可以采用间接的方法，如比色法，包括Pierce 660nm法、BCA法、Lowry法及考马斯亮蓝法，或者荧光法进行测定。这两大类方法均适用于，当待测蛋白溶液中含有明显干扰光吸收的物质，但是无法更换缓冲液的情况。关于缓冲液试剂是否会对检测方法造成影响的详细信息，请咨询试剂厂商。

注意：如果使用比色皿检测，请保证使用的比色皿可以透过紫外。并不是所有的比色皿都可以用于205或280nm的吸收光检测实验中。