NanoDrop在蛋白检测中的应用专题3[创新技巧]

蛋白定量方法的选择受缓冲液的影响

【字体: 时间:2014年01月20日 来源:

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  常用的蛋白定量方法有直接测280nm吸光值法、比色法和荧光法。选择哪种定量方法取决于多种因素,其中蛋白大概的浓度和蛋白是否经过纯化是需要考虑的因素。另一个常被忽视的因素是溶解蛋白所用的缓冲液,这个因素也应该被考虑到。

前言

常用的蛋白定量方法有直接测280nm吸光值法、比色法和荧光法。选择哪种定量方法取决于多种因素,其中蛋白大概的浓度和蛋白是否经过纯化是需要考虑的因素。另一个常被忽视的因素是溶解蛋白所用的缓冲液,这个因素也应该被考虑到。

本研究检测了多种常用蛋白缓冲液的光谱图,尤其是它们在280nm的光吸收。通过用纯的去离子水做blank,即可直接测出缓冲液的光谱图。280nm的吸光值可以帮助我们判断此种缓冲液是否适合用A280法检测蛋白浓度。

本研究还考察了A280的方法检测溶解在RIPA缓冲液(裂解液)中蛋白的浓度这种方法的准确性。这种缓冲液在UV区有较大的光吸收,是典型的不适合用A280方法。同时通过直接测A280和BCA比色法检测溶解在PBS或RIPA缓冲液中的牛血清白蛋白的浓度,以评估错误的缓冲液对检测结果的影响。

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材料和方法

我们用水做blank后测定工作浓度的PBS、M-PER、T-PER、HEPES和RIPA,得到这些常用缓冲液的光谱图同时也检测了Triton X-100,CHAPS和NDSB-201三种蛋白缓冲液中常含的成分。

将2mg/mL的BSA母液(Thermo Scientific Pierce Products Cat # 23209 )用0.05M PBS 或RIPA缓冲液( 25mM Tris-HCl(pH 7.6),150mM NaCl,1%NP-40,1% 脱氧胆酸钠和0.1% SDS(Sigma Cat # R0278))1:1稀释,制成1mg/mL的标准品(缓冲液终浓度为0.5x)。BCA法采用的标准曲线就是将该标准品按照0.5x缓冲液梯度稀释得来。

用相同浓度的BSA分别进行两组实验,一组是用0.5x PBS稀释的,一组是用0.5x RIPA缓冲液稀释的。两组样品都用Thermo Scientific NanoDrop2000c分光光度计分别用A280法和用BCA法测浓度(分别用PBS和RIPA缓冲液梯度稀释标准品做出标准曲线)。

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结果

所有蛋白缓冲液和成分检测的光图谱都显示在较低的紫外区有光吸收(图1);但吸光值在约230nm处都显著的降到0。**例外的是RIPA、NDSB和Triton X-100,这些缓冲液在280nm处有明显的光吸收(图1和图2)。

图1:不同缓冲液和缓冲液充分的光谱图(仪器用去离子水做空白)

尽管做blank时都是用的同一种溶液,但当检测分别溶于0.5xPBS和0.5xRIPA缓冲液中的BSA吸光值时,可以看到两者光谱图有显著的差别(图2)。

图2:分别溶解在PBS(红色)和RIPA(Blue)中的0.76ml/ml蛋白溶液光谱图

使用RIPA缓冲液时检测0.76ml/ml BSA样品的结果误差大于20%,检测精度降低。而用BCA比色法分别检测两种样品得到的浓度是一致的,不受缓冲液影响(图3)。

图3:分别溶于0.5x PBS和0.5x RIPA缓冲液中相同样品测得的浓度。每个样品测3个重复;误差线代表标准偏差。

如何评估缓冲液是否合适?

按照以下步骤确认缓冲液在目标的区域是否具有明显的光吸收:
1. 确认上下基座表面是否干净;
2. 进入A280应用模块,在下基座加一滴去离子水,放下上检测臂;
3. 点击Blank。检测完后,用用无尘纸擦拭基座上下表面;
4. 加一滴样品缓冲液到基座上,放下上检测臂,点击Measure。

光谱图上280nm的吸光值应≤0.04(相当于10mm光程下的吸光值)。如果大于这个值,就要考虑用比色法测蛋白浓度了。

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结论

很多缓冲液在很低的UV区有光吸收,这很有可能是缓冲液中的各种盐离子造成的。这类缓冲液不影响A280定量的准确性。

RIPA缓冲液在280nm有较强的光吸收很可能是由于其含有的NP-40或Triton X-100成分,因为这些表面活性剂在UV区有较强的光吸收。类似的,NDSB分子中的环状结构可能是导致缓冲液在UV区有强吸收的原因。

如果缓冲液在280nm有较强光吸收,则会会造成蛋白定量的不准确,因为无论哪台分光光度计,用A280法都无法通过做空白来抵消缓冲液的光吸收。

无论如何,用溶解样品用的缓冲液做空白是一种很好的做法。

本研究表明除了某些缓冲液在280nm有强烈光吸收,常用的大部分缓冲液都适合用A280的方法进行蛋白浓度测定。如果缓冲液在280nm有光吸收,可以考虑选择其他方法如比色法进行蛋白浓度测定。

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