Nature子刊:巧解基因编辑脱靶问题

【字体: 时间:2014年01月27日 来源:生物通

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  在合成蛋白CRISPR-Cas RNA引导性核酸酶(RNA-guided nucleases,RGNs)中,引导性RNA(gRNA)是一个重要的组分。麻省总医院(MGH)的研究人员发现,对gRNA的长度稍加调整,就能大幅减少预定目标之外的DNA突变。文章于一月二十六日发表在Nature Biotechnology杂志上。该研究团队去年刚刚发表文章,指出了CRISPR-Cas技术可能存在的脱靶问题。

  

生物通报道:科学家们发现,只需要对一种强力基因编辑工具作一个简单的改动,就能大大提高它的特异性。

在合成蛋白CRISPR-Cas RNA引导性核酸酶(RNA-guided nucleasesRGNs)中,引导性RNAgRNA)是一个重要的组分。麻省总医院(MGH)的研究人员发现,对gRNA的长度稍加调整,就能大幅减少预定目标之外的DNA突变。文章于一月二十六日发表在Nature Biotechnology杂志上。该研究团队去年刚刚发表文章,指出了CRISPR-Cas技术可能存在的脱靶问题。(Nature子刊:强大基因编辑工具可引起脱靶突变

“我们只是简单截短了gRNA靶标区域的长度,结果发现在之前检测到的脱靶位点,脱靶突变都大幅减少,”文章的资深作者,麻省总医院的病理系研究副主任J. Keith Joung博士说。“与全长gRNA相比,一些位点的突变频率甚至减少了5,000倍以上。重要的是在靶向它们的预定目标DNA时,这些缩短了的gRNA(称为tru-gRNA)与全长gRNA同样有效。”

CRISPR-Cas RGN结合了被称为Cas9DNA剪切酶,和一段与目标DNA片段匹配的短RNA。人们将其用于切割特定的DNA片段,以便进行基因改造。去年Joung的研究团队报告,CRISPR-Cas RGN会在人类细胞中发生脱靶,如果DNA片段与目标片段的差异在五个核苷酸以下,就会出现脱靶突变。这一问题大大限制了该技术在临床上的应用。为此研究人员继续进行研究,结果意外地发现缩短gRNA能够减少脱靶突变。

“我们去年的实验显示,gRNA互补区域一端发生几个核苷酸的错配,不会影响靶标活性,” Joung解释道。“于是我们猜想,去除这些核苷酸也许可以使整个系统对剩余序列的错配更加敏感。”

CRISPR-Cas RGN的基础是一种细菌用于抵御其他病原体的天然系统,最常见的用法是在gRNA中包含二十个核苷酸的靶向区域。为了测试他们的理论,MGH的研究团队通过逐步缩短gRNA,构建了一系列RGN。他们发现,17/18个核苷酸的靶向区域,能够比全长gRNA更有效地靶向预定序列。但如果gRNA的靶向区域只有15/16个核苷酸,活性就会很弱甚至完全没有活性。进一步研究显示,17个核苷酸的靶向区域能够有效在人类细胞中引入突变,其脱靶效应非常小,就算在只有一两个核苷酸错配的位点,也几乎检测不到脱靶。

“尽管我们还没有完全理解tru-gRNA减少脱靶效应的机制,但我们猜测原始系统拥有过多的能量,使它可以剪切不完全匹配的位点,”哈佛医学院副教授Joung说。“通过缩短gRNA,我们将能量减少到只够进行精确剪切的水平,令核酸酶无暇剪切脱靶位点。这其中的具体机制还有待进一步实验的验证。”

 

生物通编辑:叶予

生物通推荐原文:

Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs

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