《相约2015NSFC》之疾病相关lncRNA研究策略

随着2015年的自然科学基金申请日期的日益临近，广大科研工作者将开始新一轮的基金申请准备工作。锐博生物根据当前医学生物领域的热门研究方向，将陆续推出一系列的研究方案，内容涵盖《疾病相关lncRNA研究策略》、《疾病相关miRNA研究策略》、《siRNA文库高通量筛选策略》、《疾病相关Exosome研究策略》、《中医药分子水平作用机制研究策略》等，为科研工作者的课题申请提供参考，敬请关注！

1. 概述

长链非编码RNA(lncRNA)是一类转录本长度超过200nt的RNA分子，通常认为它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）参与蛋白编码基因调控。

大多数lncRNA的二级结构，剪切形式以及亚细胞定位都较为保守，这对lncRNA发挥功能非常重要。但相对于miRNA和蛋白质的功能来说，lncRNA功能机制更加难以确定，目前并不能仅根据序列或者结构来推测它们的功能。根据lncRNA在基因组上相对于蛋白编码基因的位置，可以将其分为sense、antisense、bidirectional、intronic、intergenic这5种类型。这种位置关系对于推测lncRNA的功能有很大帮助。

 
不同位置lncRNA示意图

2. lncRNA生物学功能

在哺乳动物基因组中，有4%~9%的序列产生的转录本是lncRNA（相应的蛋白编码RNA的比例是1%）。lncRNA起初被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，lncRNA会广泛参与到染色体沉默，基因组印记、染色质修饰，转录激活，转录干扰，核内运输等多种重要的调控过程，通过对已发现的lncRNA的研究，研究者已发现lncRNA能够在多种层面调控基因表达，一般来说，主要包括以下三个层次：

2.1. 表观遗传学调控
某些特异的lncRNA会招募染色质重构和修饰复合体到特定位点，改变DNA/RNA甲基化状态、染色体结构和修饰状态，进而控制相关基因的表达。很多DNA/RNA甲基化突变与癌症等某些疾病发生有关，而染色质修饰状态的改变也通常会影响到某些基因的表达状态，最常见的是在启动子区域出现的H3K4me3、H3K9me2及H3K27me3修饰等，这些组蛋白修饰会改变染色质活性，从而促进或抑制转录，控制基因表达。

这类lncRNA中，最典型的是HOXC基因簇转录的lncRNA HOTAIR，会募集染色质修饰复合体PRC2，并将其定位到HOXD基因簇位点，改变该区域的染色质修饰状态，进而抑制HOXD基因表达。已经有临床研究表明，在乳腺癌、结肠癌和肝癌等肿瘤组织中HOTAIR表达水平与肿瘤转移、复发及预后效果紧密相关，肿瘤细胞中HOTAIR高表达会抑制某些肿瘤转移抑制基因，促进肿瘤恶化，反之，沉默HOTAIR则会使肿瘤细胞丧失转移能力。除了HOTAIR，还有其他一些lncRNA可以通过募集染色质修饰复合体，对DNA/RNA和组蛋白的表观遗传状态进行修饰，如Xist，Air等。

2.2. 转录调控
在真核细胞中，转录因子对于基因转录非常重要，它们可以结合到基因转录产生的RNA上，控制RNA转录、定位和稳定性。一些lncRNA会作为配基，与一些转录因子结合，形成复合体，控制基因转录活性。例如，由一个超保守区域转录产生的lncRNA Dlx6os1既可以作为antisense RNA控制Dlx6表达，也可以通过募集DLX2或MECP2蛋白调控Dlx5和Gad1的表达。还有一些lncRNA本身就是转录因子。例如，lncRNA HSR1可以同HSF1、eEF1A共同形成复合物，在细胞热休克应激反应时调节热休克蛋白表达。另一个例子中，lncRNA GAS5会折叠成一个类似糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）DNA结合位点的结构，同GR互作，进而阻止GR发挥调控作用。在最近的研究中，有学者发现一些增强子也会通过转录产生RNA（enhancer RNA，eRNA），对特定方向距离较远的基因进行调控，不过，eRNA发挥调控作用的机制尚未确定。

2.3. 转录后调控
除了上述两种机制，lncRNA还会直接参与到mRNA转录后调控过程中，包括可变剪切、RNA编辑、蛋白翻译及转运等过程中。这些过程对于基因功能多态性非常重要。参与mRNA转录后调控的主要为antisense lncRNA，在mRNA可变剪切调控过程中，antisense lncRNA会与mRNA互补区域结合，影响某些剪切位点募集剪切体，控制mRNA剪切过程，同时也会对RNA编辑（A-to-I）产生影响。在mRNA核转运及胞内定位过程中，也有一些antisense lncRNA同mRNA互作，发挥调控作用。

2.4. 调控miRNA
除了直接调控mRNA，lncRNA还会通过控制miRNA表达来影响其靶基因的表达量。在一些肿瘤细胞和特定组织中，一些lncRNA会携带有某些miRNA的“种子序列”，像海绵一样结合miRNA，从而阻止miRNA同其靶mRNA结合。

总结起来，虽然关于lncRNA调控作用已经有很多研究，但目前还有很多关键问题没有解决，比如说，细胞如何平衡调控miRNA和lncRNA的表达、lncRNA如何得到结合miRNA的信号等。随着对lncRNA研究越来越深入，研究者也将发现更多lncRNA调控模式。

lncRNA功能示意图 来源：Yang G, Lu X, Yuan L. LncRNA: A link between RNA and cancer[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 2014.

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3. lncRNA与疾病

从现有研究成果中发现，基因表达的每一个阶段几乎都有lncRNA参与调控，lncRNA拥有信号分子（signal molecule）、诱饵分子（Decoy molecule）、引导分子（Guide molecule）和骨架分子（Scaffold molecule）等不同角色。众多证据也表明许多疾病的发生也与lncRNA的突变或失调有关，这种变化能够作为疾病诊断的标志物和潜在的药物靶点，对它们的研究将有助于开发新型靶向治疗方案，具有重要意义。

下表列出近些年来部分疾病相关lncRNA研究成果

疾病	lncRNA	lncRNA功能	功能紊乱类型
阿尔茨海默及认知障碍	BCYRN1/BC200	脑部区域BC200表达上升，阿尔茨海默症后期BC200在核周质富集。这些发现表明突触lncRNA失调与阿尔茨海默症发病有关	表达
	BC1	负向调节纹状体中多巴胺D2受体调控的突触，可能是通过抑制突触中与D2受体结合的蛋白，下调D2受体	表达
	BACE1-AS	上调BACE1 mRNA和蛋白。	表达和互作
	ANRIL (CDK2BAS/p15AS)	ANRIL中SNP与疾病有关	突变
	HAR1	作为反义lncRNA，同一些转录抑制因子结合，进入核内，影响很多重要神经相关基因表达	表达和调控
	FMR4/ASFMR1	在X染色体易裂症病人体内被沉默，在某些前突变携带者体内上调	表达
	UBE3A-AS	UBE3A反义lncRNA，抑制UBE3A表达	基因座
	17A	位于GABBR2基因座内，通过调控可变剪切影响GABA受体相关胞内信号通路，受到炎症刺激时，促进Aβ类淀粉蛋白分泌，提高Aβ42:Aβ40比例	表达
心脑血管疾病	ANRIL (CDK2BAS/p15AS)	ANRIL SNP与很多心脑血管疾病有关	突变
	DMPK 3’UTR	诱导Nkx2-5表达；DMPK突变引发肌强直性营养不良	突变
	SRA转录本	核受体信号、肌肉分化共激活因子，基因绝缘子组成部分，引起心肌收缩功能障碍
	MIAT(Gomafu/RNCR2)	SNP影响MIAT分泌，造成心肌梗塞	突变
糖尿病	ANRIL (CDK2BAS/P15AS)	ANRIL SNP与糖尿病有关	突变
	HI-LNC25	正向调节胰岛转录因子GLIS3 mRNA，	表达和突变
	IGF2-AS	GWAS确认此lncRNA与I型糖尿病有关	突变
	HI-LNC45	II型糖尿病中下调	表达
	PDZRN3-AS1	SNP与II型糖尿病发病有关	突变
	PVT1	SNP与I型和II型糖尿病有关	突变
癌症	HOTAIR	HoxC基因间转录本，招募PCR2和LSD1复合体，反式作用沉默基因	表达和表观遗传
	H19	控制Igf2表达	表达和表观遗传
	GAGE6	肿瘤抑制因子	表达
	SRA-1	SRA-1基因可变剪切体，丢失SRA-1阅读框，与肿瘤转移有关	表达
	SPRY4-IT1	在人黑色素瘤中上调	表达
	MALAT1	调控多种pre-mRNA表达，通过转录和转录后调控促进细胞运动相关基因表达	表达和互作
	MEG3	人垂体中表达上调，刺激p53相关反式激活，抑制癌症	表达、表观遗传和突变
	GAS5	控制凋亡，在乳腺癌中下调	表达和突变
	PTENP1	肿瘤抑制假基因PTEN转录本，PTENP1 3’UTR区域作为诱饵与靶向PTEN的mRNA结合	互作

4. 研究策略

在设计lncRNA相关研究课题时，要根据已有研究背景，合理设计研究策略。随着高通量技术及分析手段的不断发展，lncRNA研究方法不断进步，研究者已可以根据不同的研究目的，设计完善合理的研究策略，获得最有价值研究信息。下图罗列了目前lncRNA研究主要研究策略，研究者可以此表为参考进行课题设计
。

4.1. 差异筛选
高通量技术的发展，为疾病组织与正常组织之间的差异lncRNA初步筛选提供了强有力的工具，目前，主要的筛选工具是高通量测序（Next Generation Sequencing，NGS）及生物芯片。

生物芯片通过参考已有的数据信息，针对每个转录本设计探针，通过探针和转录本反转录产生的cDNA之间的杂交，判断不同样本之间的转录本表达差异。在进行lncRNA芯片检测时，通过选择不同容量的芯片，设计合适的探针，可以同时检测lncRNA和mRNA表达量，可对二者之间的表达关系进行分析。生物芯片本质上是核酸杂交，整个芯片系统也是一个封闭的系统，不能检测探针没有覆盖到的区域；而近些年来逐渐流行起来的NGS，是一个开放的系统，理论上讲，按照流程，不管有没有参考序列信息，都可以进行检测（de novo和re-sequencing）。所以，生物芯片不能发现新的lncRNA，而NGS则可以发现一些未知lncRNA。

高通量技术不同于高数量技术，它的优势在于同时检测成千上万个基因或转录本，并非同时检测成千上万个样本。如果只是想检测有限的几个lncRNA表达差异，大可不必选择高通量技术，通过一代测序及qPCR即可达到筛选目的。而对于生物芯片或NGS筛选出的表达差异，也需要通过一代测序、qPCR、Northern Blot及RNA-FISH等技术手段进行验证，以确保筛选准确度。

4.2. 数据分析
如果说初步筛选主要是硬件层面选择的话，数据分析则是软件层面比拼，分析方法和内容直接决定了原始数据利用率。目前lncRNA研究主流的数据分析包括表达差异lncRNA分析、新lncRNA预测、lncRNA-mRNA共表达网络构建等，高级分析包括基因融合、RNA编辑、SNP分析、lncRNA功能预测等内容。研究者可根据自己的研究目的，自由定制分析内容，最高效率利用数据。

4.3. 机制探索
初步筛选与生物信息分析完成后，需要对所获得的差异lncRNA进行功能和调控机制上的探索。功能研究主要包括功能获得（gain of function）和功能缺失（loss of function）研究。在功能获得研究中，主要利用lncRNA过表达载体，在细胞中特异性上调lncRNA，结合其他技术来检测细胞表型及内部变化，包括染色质组蛋白变化（ChIP-Seq/ChIP-on-chip/ChIP-qPCR等）、RNA结合蛋白变化（RIP-Seq等）、“miRNA”海绵效应（miRNA表达谱芯片等）等，以确认lncRNA过表达对细胞的影响；而在进行功能缺失研究时，则主要采用RNAi的方法，包括设计siRNA、构建shRNA载体等手段，沉默lncRNA，再考察细胞变化。

对于lncRNA表达出现差异的机制研究，思路同mRNA差异分析类似，主要是从基因组蛋白表观修饰状态、DNA甲基化状态及重要转录因子结合模式等方面考察，所用到的实验手段包括ChIP-Seq、BS、荧光素酶重组子验证等。

完成lncRNA功能及调控机制的研究后，可基本确认lncRNA从哪里来，到哪里去，接下来需要结合研究目的，进行其他方向的功能研究，如lncRNA对细胞凋亡、lncRNA对癌细胞转移的影响等内容。最后，需要利用活体实验验证体外功能，一般选择小动物活体成像平台，通过设计动物用siRNA或过表达载体，靶向改变动物体内特定范围的lncRNA表达量，观察动物体内变化，如肿瘤大小、癌细胞转移情况等。对于有条件的研究者，也需要在进行功能研究时辅以临床数据验证，可更有说服力地证明lncRNA是否能够在未来成为一个新药开发的特殊靶点。

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