Nature Methods对话诺贝尔奖得主：获奖技术适合你么？

美国科学家Eric Betzig、William Moerner 和德国科学家Stefan Hell，因为对超高分辨率显微镜所做出的贡献，获得了2014年诺贝尔化学奖。Nature Methods杂志之前曾与两位诺贝尔奖得主（Eric Betzig和Stefan Hell）对话，探讨了超高分辨率显微技术的实际应用。

生物通报道：美国科学家Eric Betzig、William Moerner 和德国科学家Stefan Hell，因为对超高分辨率显微镜所做出的贡献，获得了2014年诺贝尔化学奖。

几个世纪以来，光学显微镜的“衍射极限”一直被认为是无法超越的。这些科学家们从不同途径“突破”了这一极限，使人们能够分辨相距少于200nm的两个物体。这类技术被统称为超高分辨率显微技术或纳米显微技术（nanoscopy）。

Nature Methods杂志之前曾与两位诺贝尔奖得主（Eric Betzig和Stefan Hell）对话，探讨了超高分辨率显微技术的实际应用。

超高分辨率显微技术难不难？

目前主要的超高分辨率技术包括：光激活定位显微技术PALM、随机光学重建显微技术STORM、受激发射损耗STED，结构照明显微技术SIM和RESOLFT。其中，PALM和STORM属于单分子定位显微技术。另外据Eric Betzig介绍，使用栅格的SIM其实不是完全意义上的超高分辨率技术。从概念上看，SIM并没有突破衍射极限。

这些技术当然不像共聚焦显微镜那么简单，NIBIB的超高分辨率成像专家Hari Shroff说。不过随着超高分辨率显微技术的商业化，仪器价格的逐渐降低（虽然还是蛮高），越来越多的科学家们能够从中获益。因此了解这类技术是很有必要的，Betzig说。

超高分辨率显微技术的样本制备是非常严格的，耗时也比较久。研究者们不能直接沿用共聚焦显微技术的样品制备方案，Shroff说。

从操作上看，STED显微镜其实跟共聚焦显微镜差不多。“按个按钮，图像就出来了，” Stefan Hell指出。该技术不需要图像处理，原始数据就是图像。据介绍，STED显微镜用户不用确切知道这一技术的作用原理，只需要保证STED光的波长与所用的荧光团相符。

需要注意的是，用PALM/STORM技术在200nm区间内进行成像时可能产生假象，Hell说。不过，PALM/STORM将用户直接带到单分子水平，简化了在图像上计数的过程。对于固定细胞而言，这类技术可以轻松超越30 nm的分辨率。

在Betzig看来，STED没有PALM/STORM灵便，让STED正确工作并不容易。而Hell强调，STED有潜在的速度优势。该技术不是一个个地读取荧光分子，用户能以可控模式在20到200 nm之间调节。不需要超高分辨率的时候，成像速度就可以大大加快，Hell说。

超高分辨率成像应该注意些什么？

对于研究细胞器或细胞膜内部的细胞生物学家而言，大多数需要检测的活动发生在低于200nm的水平上。

生物学家们用超高分辨率技术成像时，应该特别提高警惕。举例来说，在100 nm水平上，荧光蛋白的过表达可能会使成像出现偏差，光强也会对样本产生的影响。另外，如果想要获得20-nm分辨率，像素大小至少要在10 nm左右。

---

PALM/STORM和STED对染色有更高的要求。共聚焦显微镜可以接受较低的标记密度（lower marker），但超高分辨率显微镜必须有高密度的标记。

我们在进行超高分辨率成像时，应当时刻提醒自己注意图像的真实性，想办法设立正确的对照。比如用电镜（EM）和抗体对结果进行验证。另外，还可以在计算机上模糊化PALM图像，得到类似于共聚焦显微镜的图像。这些方法可以帮助研究者获得更加全面的信息。

最后我们需要注意的是，在超高分辨率成像时，所有来自样本的光子都非常珍贵。

固定细胞成像

成像固定细胞时，可以不用太担心对细胞造成的伤害。电镜EM在整体对比度上很有优势，不过光学成像能够通过荧光标记，获得蛋白特异性的稳定对比度，Betzig指出。

他认为，成像固定细胞是PALM技术的长项，在遗传编码的EM标记出现以前，PALM都将在这一领域占据优势。现在一些实验室正在将PALM和EM结合起来，虽然他们取得成功还需要一定的时日，Betzig相信不过那一天终将来临。

作为PALM技术的开发者，Betzig承认对自己的技术有一定的偏爱。他介绍道，STED技术“看起来很美”，不过PALM有着自己的优势，PALM不用STED那么高的光强，就传递单分子信息。在试图超越50 nm分辨率时，STED存在破坏固定样本的风险。

STED技术的发明者Hell并不同意这样的观点。他认为STED出现假象的风险更低，而且这一技术的新改良可以克服上述问题。Hell 还指出，PALM/STORM需要用户有足够的专业知识才能正确使用。当然正确的PALM/STORM成像也能产出丰厚的数据。

活细胞成像

对于活细胞成像而言，光毒性是很重要的。能不能在突破光学极限、快速获得大量时空数据的同时，保持低水平的光毒性呢？可惜，世界上没有十全十美的事。我们只能在成像质量与细胞损伤之间做出痛苦的权衡。

Betzig很看好将单颗粒显微技术与PALM结合起来的sptPALM技术，该技术能够追踪蛋白在细胞内的移动。在这一技术之前，人们只能跟踪大约一百个分子。而sptPALM技术在同一个细胞中跟踪数千个分子。 Betzig认为，这是研究活细胞扩散事件的最有力方式。

 

生物通编辑：叶予

生物通推荐原文：

Is super-resolution microscopy right for you?