Nature Methods对话诺贝尔奖得主:获奖技术适合你么?

【字体: 时间:2014年10月10日 来源:生物通

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  美国科学家Eric Betzig、William Moerner 和德国科学家Stefan Hell,因为对超高分辨率显微镜所做出的贡献,获得了2014年诺贝尔化学奖。Nature Methods杂志之前曾与两位诺贝尔奖得主(Eric Betzig和Stefan Hell)对话,探讨了超高分辨率显微技术的实际应用。

生物通报道:美国科学家Eric BetzigWilliam Moerner 和德国科学家Stefan Hell,因为对超高分辨率显微镜所做出的贡献,获得了2014年诺贝尔化学奖。

几个世纪以来,光学显微镜的“衍射极限”一直被认为是无法超越的。这些科学家们从不同途径“突破”了这一极限,使人们能够分辨相距少于200nm的两个物体。这类技术被统称为超高分辨率显微技术或纳米显微技术(nanoscopy)。

Nature Methods杂志之前曾与两位诺贝尔奖得主(Eric BetzigStefan Hell)对话,探讨了超高分辨率显微技术的实际应用。

超高分辨率显微技术难不难?

目前主要的超高分辨率技术包括:光激活定位显微技术PALM、随机光学重建显微技术STORM、受激发射损耗STED,结构照明显微技术SIMRESOLFT其中,PALMSTORM属于单分子定位显微技术。另外据Eric Betzig介绍,使用栅格的SIM其实不是完全意义上的超高分辨率技术。从概念上看,SIM并没有突破衍射极限。

这些技术当然不像共聚焦显微镜那么简单,NIBIB的超高分辨率成像专家Hari Shroff说。不过随着超高分辨率显微技术的商业化,仪器价格的逐渐降低(虽然还是蛮高),越来越多的科学家们能够从中获益。因此了解这类技术是很有必要的,Betzig说。

超高分辨率显微技术的样本制备是非常严格的,耗时也比较久。研究者们不能直接沿用共聚焦显微技术的样品制备方案,Shroff说。

从操作上看,STED显微镜其实跟共聚焦显微镜差不多。“按个按钮,图像就出来了,” Stefan Hell指出。该技术不需要图像处理,原始数据就是图像。据介绍,STED显微镜用户不用确切知道这一技术的作用原理,只需要保证STED光的波长与所用的荧光团相符。

需要注意的是,用PALM/STORM技术在200nm区间内进行成像时可能产生假象,Hell说。不过,PALM/STORM将用户直接带到单分子水平,简化了在图像上计数的过程。对于固定细胞而言,这类技术可以轻松超越30 nm的分辨率。

Betzig看来,STED没有PALM/STORM灵便,让STED正确工作并不容易。而Hell强调,STED有潜在的速度优势。该技术不是一个个地读取荧光分子,用户能以可控模式在20200 nm之间调节。不需要超高分辨率的时候,成像速度就可以大大加快,Hell说。

超高分辨率成像应该注意些什么?

对于研究细胞器或细胞膜内部的细胞生物学家而言,大多数需要检测的活动发生在低于200nm的水平上。

生物学家们用超高分辨率技术成像时,应该特别提高警惕。举例来说,在100 nm水平上,荧光蛋白的过表达可能会使成像出现偏差,光强也会对样本产生的影响。另外,如果想要获得20-nm分辨率,像素大小至少要在10 nm左右。


PALM/STORMSTED对染色有更高的要求。共聚焦显微镜可以接受较低的标记密度(lower marker),但超高分辨率显微镜必须有高密度的标记。

我们在进行超高分辨率成像时,应当时刻提醒自己注意图像的真实性,想办法设立正确的对照。比如用电镜(EM)和抗体对结果进行验证。另外,还可以在计算机上模糊化PALM图像,得到类似于共聚焦显微镜的图像。这些方法可以帮助研究者获得更加全面的信息。

最后我们需要注意的是,在超高分辨率成像时,所有来自样本的光子都非常珍贵。

固定细胞成像

成像固定细胞时,可以不用太担心对细胞造成的伤害。电镜EM在整体对比度上很有优势,不过光学成像能够通过荧光标记,获得蛋白特异性的稳定对比度,Betzig指出。

他认为,成像固定细胞是PALM技术的长项,在遗传编码的EM标记出现以前,PALM都将在这一领域占据优势。现在一些实验室正在将PALMEM结合起来,虽然他们取得成功还需要一定的时日,Betzig相信不过那一天终将来临。

作为PALM技术的开发者,Betzig承认对自己的技术有一定的偏爱。他介绍道,STED技术“看起来很美”,不过PALM有着自己的优势,PALM不用STED那么高的光强,就传递单分子信息。在试图超越50 nm分辨率时,STED存在破坏固定样本的风险。

STED技术的发明者Hell并不同意这样的观点。他认为STED出现假象的风险更低,而且这一技术的新改良可以克服上述问题。Hell 还指出,PALM/STORM需要用户有足够的专业知识才能正确使用。当然正确的PALM/STORM成像也能产出丰厚的数据。

活细胞成像

对于活细胞成像而言,光毒性是很重要的。能不能在突破光学极限、快速获得大量时空数据的同时,保持低水平的光毒性呢?可惜,世界上没有十全十美的事。我们只能在成像质量与细胞损伤之间做出痛苦的权衡。

Betzig很看好将单颗粒显微技术与PALM结合起来的sptPALM技术,该技术能够追踪蛋白在细胞内的移动。在这一技术之前,人们只能跟踪大约一百个分子。而sptPALM技术在同一个细胞中跟踪数千个分子。 Betzig认为,这是研究活细胞扩散事件的最有力方式。

 

生物通编辑:叶予

生物通推荐原文:

Is super-resolution microscopy right for you?

 

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