RPA技术试水二代测序的文库制备

【字体: 时间:2014年11月03日 来源:生物通

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  为此,Wellcome Trust Sanger 研究所的研究团队对测序文库的制备进行了优化,找到了既适合低量样本又耐受高AT含量的文库制备方案。这项研究发表在2012年的BMC Genomics杂志上。

生物通报道:重组酶聚合酶扩增RPA被称为是可以替代PCR的核酸检测技术。RPA扩增的速度非常快,灵敏度高,对硬件设备要求低,而且不需要复杂的样本处理。这样的技术特别适合于体外诊断、兽医、食品安全、生物防御、农业等领域。

大规模并行测序技术(即二代测序NGS)是基因组和遗传学领域的一次技术革命。NGS自诞生以来,不论是测序规模还是测序效率都有了飞速的提升。尽管这一技术已经取得了巨大的成功,但有着极端碱基组成的基因组区域,对于目前的NGS平台来说仍然是一个很大的挑战。

不少重要的病原体都具有极端的碱基组成,比如疟原虫(高AT含量)和结核杆菌(高GC含量)。PCR扩增是标准的文库制备程序,不过PCR会导致不均匀的读取覆盖度(特别是在富含ATGC的区域),最终影响基因组的装配和变异分析。而省却PCR扩增的文库制备方案,需要大量的初始材料,不适合处理从临床上分离的样本。

为此,Wellcome Trust Sanger 研究所的研究团队对测序文库的制备进行了优化,找到了既适合低量样本又耐受高AT含量的文库制备方案。这项研究发表在2012年的BMC Genomics杂志上。

研究人员用非临床和临床分离物(含大约53%的宿主污染物)制备Illumina测序文库,分别使用了不同的聚合酶、PCRRPA方法,并对测序结果进行了分析和比较。他们在此基础上增强了高AT含量区域的测序覆盖度,减少了极端碱基组成带来的偏向性。

这项研究的RPA等温扩增直接使用了TwistAmp基础反应,没有进行任何优化。结果显示,RPA制备测序文库时产量相对较高,与标准Illumina文库制备相比,对极端碱基组成的模板偏向性较少,覆盖度有一定的提升。不过测序后的嵌合和重复读取(chimeric and duplicate reads)相对较多。(延伸阅读:核酸检测的一场革命,可替代PCR的犀利技术

这次尝试说明,未来经过优化的RPA技术将有望用于二代测序的样本制备。(参考文献:Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.

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