《相约2015NSFC》之疾病相关外泌体RNA研究策略

随着2015年的自然科学基金申请日期的日益临近，广大科研工作者将开始新一轮的基金申请准备工作。锐博生物根据当前医学生物领域的热门研究方向，将陆续推出一系列的研究方案，内容涵盖《疾病相关lncRNA研究策略》、《疾病相关miRNA研究策略》、《siRNA文库高通量筛选策略》、《疾病相关Exosome研究策略》、《中医药分子水平作用机制研究策略》等，为科研工作者的课题申请提供参考，敬请关注！

概述

外泌体（exosome）最早是由细胞内多泡体(multivesicular body, MVB) 与细胞膜融合后, 释放到细胞外基质中的一种直径约30~120nm 的膜性囊泡。最早由Johnstone等研究者在研究网织红细胞向成熟红细胞转变过程时发现。又经过多年研究，科学家发现除了网织红细胞以外，T细胞、B细胞、血小板、树突细胞、肥大细胞等血细胞及上皮细胞、肿瘤细胞等其他非血源性细胞都会分泌外泌体，被分泌出的外泌体会进入血液、唾液、尿液、及乳汁等体液中，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。
  
外泌体组成与其来源有关，但一般而言，外泌体都会含有以下几种物质：MHC I类和/或II类分子、热休克蛋白（hsp）、四跨膜蛋白、整合素、细胞骨架蛋白以及一些生物酶类。虽然外泌体形成过程已大致确定，但是这个过程的精确分子机制及外泌体所携带的“货物”的组成和功能依然有很多未知。最早时，外泌体只被认为是细胞的“垃圾袋”，让细胞摆脱一些无用蛋白，但在最近数年研究中发现，外泌体所携带的的“货物”具有重要的生物学意义，尤其外泌体所包含的许多RNA分子已被证实会参与到肿瘤发生等重要疾病发生过程。且由于外泌体的特殊组成，保证它能够广泛参与到细胞通讯过程中，具有很好的药物释放系统开发潜力。

外泌体结构示意图 图片来源：J O'Loughlin A, A Woffindale C, JA Wood M. Exosomes and the emerging field of exosome-based gene therapy[J]. Current gene therapy, 2012, 12(4): 262-274.

外泌体体积大小对比 图片来源：Tan A, Rajadas J, Seifalian A M. Exosomes as nano-theranostic delivery platforms for gene therapy[J]. Advanced drug delivery reviews, 2013, 65(3): 357-367.

外泌体产生及去向

外泌体的具体形成机制目前仍然不是十分清楚，但现有研究认为，不同类型的细胞形成外泌体的过程可能大同小异。细胞通过内吞作用产生小囊泡，小囊泡融合形成早期核内体（early endosome），并逐渐变为晚期核内体（late endosome）。随着胞质内miRNA、酶分子、热休克蛋白等一些“货物”的进入，晚期核内体会产生很多小囊泡（intraluminal vesicles，ILVs），并逐渐演变成多泡体（multivesicular body，MVB）；随后，这些小囊泡会被释放到胞外，形成外泌体。

在被细胞释放后，外泌体会进入体液，随着循环系统到达其他细胞或组织内。在外泌体表明会有很多特殊标志物，以区别来源。不同来源的外泌体会通过内吞作用进入受体细胞，这个过程有三种不同机制：

a）外泌体进入受体细胞后，将“货物”释放进入胞质内，并重新形成多泡体；
b）外泌体将“货物”释放进入胞质，但自身与细胞质膜融合；
c）外泌体上的配体与受体细胞膜上特殊受体结合，既能起到信号传导作用，也能通过内吞作用，将“货物”运入胞内。

外泌体生物学过程示意图 图片来源J O'Loughlin A, A Woffindale C, JA Wood M. Exosomes and the emerging field of exosome-based gene therapy[J]. Current gene therapy, 2012, 12(4): 262-274.

外泌体RNA

外泌体中包含多种RNA分子，包括mRNA、miRNA等。但也有少数报道指出，某些特殊来源的外泌体也会包含DNA分子，例如，有研究者发现恶性胶质瘤及星形细胞瘤细胞所释放的外泌体中可能含有线粒体DNA（Guescini et al. , 2010）。自2007年首次在外泌体中发现mRNA和miRNA，研究者已在人类及小鼠外泌体中发现了数千个不同mRNA，而且有些转录本只存在于外泌体中，在胞内却无法检测到。这表明，RNA进入外泌体的过程会受到某些特殊的分选机制控制。目前，外泌体RNA分子收录最全的数据库是ExoCarta（http://www.exocarta.org/），此数据库共收录2375个外泌体mRNA和764个miRNA，但是这也仅仅是能够检测到的所有外泌体RNA的一部分，仍旧有大量外泌体RNA的功能未知。

生物学功能	外泌体RNA	来源	参考文献
转录调控、蛋白激酶及其他酶类调控、翻译调控	类型： 47个基因的1300个mRNA产物	肥大细胞	Valadi et al. , 2007
控制干细胞分化、器官发育、胞吐作用及肿瘤发生	类型：120个miRNA（let-7、miR-1等）	肥大细胞	Valadi et al. , 2007
转录调控、细胞信号调控、不同酶表达调控、细胞分化调控	类型：由Topol、Ccbp2、KRIT1、Amy2a1、2FP、38PC、PHD finger protein 6、Sox15基因转录产生的	肥大细胞	Eldh et al. , 2010
上呼吸道胞间通讯，多种上呼吸道疾病标志物	类型：miRNA	人类鼻腔分泌物	Lässer et al., 2011
细胞生长调控、肿瘤微环境控制	类型：EBV miRNAs	鼻腔癌细胞	Meckes et al., 2010
心血管疾病标志物	类型：肌肉特异性循环miRNA	激活的H9C2心肌细胞和小鼠心梗模型血浆	Kuwabara et al., 2011
细胞周期控制，生理学过程控制，生长、繁殖调控	类型：由annexins、moesin、IL-6、EEF2、keratin 6A、OS9转录产生的509个mRNA	人唾液	Palanisamy et al. , 2010
唾液产生突变，唾腺周围炎症反应，唾腺瘤产生	类型：miRNA，在Sjogren综合症病人体内高表达	人唾液	Michael et al. , 2010
血管生成、细胞增殖、炎症反应、细胞迁移、组蛋白修饰等	类型：27000个转录本中有4700个mRNA只出现在外泌体中	原发性胶质母细胞瘤	Skog et al. , 2008
致瘤突变	类型：mRNA，EGFR VIII突变	胶质母细胞瘤患者血清	Skog et al. , 2008
miRNA参与肿瘤发生	类型：肿瘤特异性miRNA（如miR-21,let-7a,miR-16）	原发性胶质母细胞瘤细胞	Skog et al. , 2008
细胞分化、代谢调控、免疫调控	类型：104个特异表达的miRNA	人血浆	Hunter et al. , 2008
血管生成，内皮细胞激活与增殖	类型：mRNA/miRNA	胰腺肿瘤细胞	Nazarenko et al. , 2010
miRNA参与肿瘤发生	类型：8个外泌体特异性miRNA	卵巢肿瘤细胞	Taylor、 Gercel-Taylor, 2008
蛋白翻译与合成	类型：engrailed 1、CAM kinasell α、AmPA受体、TEF 1A/2基因转录产物	突触后外泌体	Smalheiser , 2009
TNF信号	类型：胎盘特异性miRNA	人类细胞	Luo et al. , 2009
沉默靶点基因	类型：MAP1外源siRNA	外周血	Wahlgren et al. , 2012
在小鼠大脑中下调BACE1和β-淀粉样蛋白水平	类型：BACE1外源siRNA（外泌体被改造为可表达LAMP2）	非成熟树突状细胞	Alvarez-Erviti et al., 2011

部分已报道的外泌体RNA功能 来源：Fais S, Logozzi M, Lugini L, et al. Exosomes: the ideal nanovectors for biodelivery[J]. Biological chemistry, 2013, 394(1): 1-15.

由于外泌体天生的运输作用，RNA可以跟随外泌体到达较远距离的细胞中，并对细胞产生影响，产生不同表型，这对于远距离细胞通讯具有很重要的意义。对于RNA进入外泌体的机制，有研究者发现，进入外泌体的RNA分子一般会有一个特殊的顺式作用元件，作为外泌体RNA的一个标志，引导特殊RNA进入外泌体中。现有疾病研究中已经发现，有些miRNA会通过外泌体到达其他细胞组织，为一些癌细胞营造一个适合转移的微环境，从而促进癌细胞转移，造成癌症患者较差的预后效果，所以，外泌体RNA也可以成为某些疾病的特殊标志物，并用于疾病的诊断及预后效果考察。

外泌体RNA研究策略

差异筛选

随着高通量技术的不断发展，目前对于外泌体RNA的研究也已经进入新的阶段。对于不同类型的外泌体RNA（mRNA、lncRNA或miRNA等），在功能探索方面会有所不同，但与一般的RNA分子功能研究方法并无本质区别。对于外泌体RNA研究，在进行差异筛选之前，首先要进行外泌体的提取，传统的提取方法为连续低温梯度超速离心。这种方法提取成本低，但提取效率低，耗时长。最近几年，已经一些有成熟的外泌体提取试剂盒上市，这些试剂盒不需要特殊设备，可以非常方便快捷地提取外泌体及其所携带的RNA。此类试剂盒中，有的是利用特殊设计的过滤器过滤掉非外泌体成分，同时把外泌体中的RNA成分释放出来，直接用于接下来的实验；有的则是高分子聚合物的体积排阻效应，把外泌体沉淀出来。但是，也有研究者认为，这种方法的特异性不佳，无法区分真正的外泌体和其他非外泌体微小颗粒。

理论上讲，要更为细致地分选出不同来源的外泌体，需要使用CD63、CD81、CD82、CD9、EpCAM和Rab5等外泌体特殊标志物的抗体进行亲和纯化，有公司也已经开发出用于此类分选的微阵列芯片或孔板，可已非常精确地富集出不同来源的外泌体。除了使用此类抗体进行亲和纯化，也有研究者针对外泌体表面特殊的一些残基进行亲和纯化，如糖基、小的肽段等。

完成外泌体及其所包含的RNA分子提取后，可进一步选择高通量技术进行大规模差异筛选，目前用于RNA差异筛选的高通量技术手段主要为高通量测序（Next Generation Sequencing，NGS）及生物芯片。

生物芯片通过参考已有的数据信息，针对每个转录本（lncRNA、miRNA或mRNA）设计探针，通过探针和转录本反转录产生的cDNA之间的杂交，判断不同样本之间的转录本表达差异。生物芯片本质上是核酸杂交，整个芯片系统也是一个封闭的系统，不能检测探针没有覆盖到的区域；而近些年来逐渐发展起来的NGS，是一个开放的系统，理论上讲，按照流程，不管有没有参考序列信息，都可以进行检测（de novo和re-sequencing）。所以，生物芯片不能发现新的转录本，而NGS则可以发现一些未知转录本。

高通量测序技术准确性和灵敏度都高于生物芯片，同时可以获得更多准确的RNA信息，特别是小RNA分子的数据，包括miRNA和piRNA等信息。

数据分析

对于外泌体RNA数据分析内容，本质上与其他RNA研究方法一致。对于miRNA，分析内容主要包括外泌体与分泌细胞间、外泌体与受体细胞间、正常细胞外泌体与病变细胞外泌体间、病变细胞外泌体与正常细胞间miRNA表达差异分析、miRNA表达聚类分析、外显子/内含子注释等，高级分析包括miRNA靶基因预测、miRNA碱基编辑分析、miRNA调控网络构建等内容。特别是针对外泌体miRNA的研究，由于里面包含的miRNA数量较多，往往在功能是起到协同作用，因此利用exosome miRNA调控网络分析，更容易获得外泌体中miRNA的宏观生物学功能及主要miRNA成分的靶基因信息。

Exosome miRNA调控网络研究，离不开生物信息学和系统生物学。运用生物信息学的方法和技术通过数据采集、分析、建模、模拟和推断等手段研究复杂的miRNA调控网络关系，揭示有关的作用机理。

构建原理：1、分别分析若干个miRNAs下游调控的靶基因；2、多个miRNA的靶基因之间相互作用的关系分析；3、对miRNA上游调控调控因子进行分析，例如TF等；4、将上述数据进行整合，构建miRNA调控网络；5、调控网络元素重要性分析；6、靶基因网络KEGG、GO分析

图例 miRNA调控网络构建原理

实例：

图例 miRNA与靶基因相互作用网络

如上图，黄色菱形为miRNA，浅蓝色圆点为靶基因，深蓝色线条是蛋白互作关系，红色线条是miRNA与基因的靶向关系。可见miRNA调控的基因数目有较大差异，这可能就揭示了该miRNA在调控网络中处于关键的位置。再通过蛋白互作网络元素权重分析，可从中预测重要的靶基因，为下一步功能验证奠定基础。

功能探索

差异筛选与生物信息分析完成后，需要对所获得的差异RNA进行功能和调控机制上的探索。功能研究主要包括功能获得（gain of function）和功能缺失（loss of function）研究。外泌体主要参与胞间通讯，研究外泌体中RNA对于受体细胞的影响，可以使用外泌体与受体细胞共同孵育，利用FISH、FACS等技术检测外泌体中RNA分子进入受体细胞的机制与过程，但是要区分受体细胞变化是否真的是由于外泌体RNA所引起，而非自身RNA变化所导致，可使用RNAi等方法构建RNA缺陷细胞，再使用外泌体进行孵育，观察突变细胞变化。对于外泌体miRNA研究，也可借助荧光素酶报告质粒，通过检测受体细胞与外泌体孵育后的荧光变化，确认外泌体miRNA是否进入细胞。还有一种方法就确定外泌体所存在的miRNA分子后，可以通过化学合成带荧光标记的模拟物，转染进外泌体供体细胞，然后收集供体细胞所分泌的外泌体，加入到受体细胞培养体系中，几个小时后可以通过荧光显微镜或者流式细胞术检查受体细胞是否存在荧光信号，以此判断受体细胞分泌的exosome 是否进入到受体细胞里面。研究者可根据实际研究需要，合理设计验证实验。对于外泌体对受体细胞的影响，可使用qPCR、测序和芯片、WB等技术手段检测受体细胞中其他基因变化，分析通路影响及细胞表型变化（增殖、凋亡、侵袭转移等），以确认外泌体RNA功能。

而对于外泌体RNA的调控机制研究，从目前已有研究结果来看，分泌细胞中RNA转录上升并不足以驱动外泌体RNA产生差异，这个过程依然有其他机制参与。目前认为，受体细胞的某些变化会促使一些RNA分子从分泌细胞被特异性地分选进入外泌体，再经过循环系统到达受体细胞。因为这个特性，外泌体RNA分子可以成为某些疾病的血液标志物，用于早期诊断和治疗。

总结

2013年，美国、德国3位科学家凭借他们所发现的细胞囊泡运输的调节机制，荣获2013年诺贝尔生理学或医学奖。而外泌体作为细胞囊泡运输中非常重要的组成部分，开始受到越来越多的关注，相信日后会有更多外泌体RNA相关机制和功能被发现。而外泌体RNA研究策略也将不断丰富与完善。

外泌体RNA研究策略示意图

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