PCR替代技术，RPA引物与探针的常见问题

生物通报道：重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司TwistDx Inc开发）。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

RPA扩增的基础体系（TwistAmp® Basic）含有DNA扩增所需的所有试剂，我们只要准备好引物和模板就行。在这个基础体系中添入不同的酶和探针，可以实现多样化的RPA应用，比如RNA扩增检测和实时RPA检测等等。

RPA反应需要用多少引物？

RPA基础反应每次需要480nM引物，TwistAmp® exo、TwistAmp® fpg和TwistAmp® nfo每次需要420nM引物。有时，稍微改动一下引物的用量可以提高其性能。对不同引物浓度进行测试（从200nM 到600nM）将有助于找到最合适的引物浓度。

RPA反应需要用多少探针？

RPA反应一般每次需要120nM探针。不过，略微改变探针的浓度有时会促进反应的进行。我们可以在一定浓度范围内（从50nM到150nM），根据自己的具体应用对探针进行优化。

现成的PCR引物能用于RPA么？

多半不行。绝大多数PCR引物不能用于RPA，因为它们太短了重组效率低。

现成的PCR探针能用于RPA么？

不能。绝大多数常用的PCR探针并不适合RPA反应。特别是用到了聚合酶5’-3’核酸酶活性的探针系统，这样的酶活性与RPA根本不兼容。

怎样才算是好引物？我应该怎样设计RPA引物？

RPA引物还没有一个严格的设计标准，所以需要进行筛选。（引物设计具体参见：PCR替代技术，RPA全攻略之引物设计）

RPA引物需要多长？

RPA引物一般在32至35个核苷酸之间。某些情况可能用到少于30个核苷酸的引物，但扩增过程会显著减缓。

RPA引物应当相距多远？

这取决于你的具体应用。标准TwistAmp®试剂盒适用于不超过500bp的扩增产物。RPA扩增产物的大小是没有下限的，不过RPA引物一般需要扩增子超过80bp。扩增产物在100-200bp之间，可以实现最快的RPA扩增。

在特定条件下，RPA扩增产物能够达到2kb。不过，目前的TwistAmp®试剂盒无法生成这么大的片段。

我需要筛选多少引物？

这取决于你对检测灵敏度的要求。举例来说，如果目标分子上千，那么绝大多数引物都够用了。对灵敏度要求很高的话，最好是进行系统性的引物筛选。一开始筛选的时候，候选引物可以有10到20对。测试的引物越多，找到好引物的几率也就越大。

 

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筛选引物的时候必须用探针么？

不一定。任何检测方法都可以用来评估候选引物的性能。不过对于筛选高灵敏度引物来说，用检测探针对扩增进行实时监控被证明是最快也最省力的方法。

引物筛选时应该用什么样的条件？

引物筛选的条件最好尽量模拟实际检测时的条件，例如模板的拷贝数、样本纯度等等。

给定引物的性能还能再提高么？

一般来说，稍微改动一下引物的序列可以提高其RPA性能。任何给定的引物都可以通过以下方法进行优化：以单核苷酸为基础略微改变引物的长度；或者保持引物长度不变，以1bp为基础移动引物的位置。经过了改动的引物，需要重新进行扩增活性的测试。

RPA引物的熔解温度应该是多少？

RPA反应是在常温下进行的，DNA的解链与PCR有很大不同。传统估算的熔点不适用于这个系统。

RPA引物需要特别纯化么？

在进行引物筛选的时候，一般不需要纯化。在其他情况下，引物的质量会造成批次间的差异。如果对一致性要求比较严格，最好先纯化引物再进行RPA反应。

经过一种TwistAmp®试剂盒测试的引物，能直接用于其它TwistAmp®试剂盒么？

不一定。举例来说，经TwistAmp®基础试剂盒测试的引物，不能直接用于exo或nfo试剂盒，因为exo和nfo还要把探针纳入考虑。另外，跑胶检测、荧光检测或侧流层析检测对引物有不同的要求，不能一概而论。DNA检测和RNA检测也一般不能共用引物，因为逆转录酶和聚合酶有着不同的偏好。

我要怎么选择探针？

TwistAmp官网上提供有不同检测探针的设计指南。需要注意的是，TwistAmp® exo探针有一些特殊的限制。TwistAmp® fpg的探针设计更为灵活，但它生成的荧光信号没有TwistAmp® exo探针强。

使用引物和探针的时候还需要注意些什么？

引物和探针需要同时添加到体系中，一先一后会使片段重组出现偏向性。

 

生物通编辑：叶予