替代PCR，RPA成为致病菌检测的得力工具

生物通报道：重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被称为是可以替代PCR的核酸检测技术（由英国公司TwistDx Inc开发）。以此为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测。该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

在今年发表的一系列文章中，RPA技术被广泛用于结核杆菌、耐药菌MRSA、沙门氏菌等常见致病菌的检测。在临床诊断和食品安全方面，为人们提供了简单快速的实地筛查方案。

RPA在临床诊断领域的应用

艰难梭状芽孢杆菌（C. difficile）是一种会引起感染性腹泻的重要致病菌。日前，研究人员以这种致病菌的毒力基因tcdB为靶标，开发了一个低成本的微流体RPA平台，文章发表在十月二十三日的《Analyst》杂志上。这个检测C. difficile的RPA分析芯片只需要6.4 µL的初始样本，能够对扩增反应进行实时监控。（参考文献：Real-time microfluidic recombinase polymerase amplification for the toxin B gene of Clostridium difficile on a SlipChip platform）

据估计，世界上约三分之一的人体内潜伏着结核病（TB）的致病菌，这些致病菌大多在肺部处于休眠状态。改善检测方法帮助TB诊断，被WHO列为公共建康的首要问题之一。RPA作为一种常温的快速DNA 扩增法，为资源匮乏的地区提供了检测TB的简便工具。研究人员在RPA的基础上，快速检测了结核分枝杆菌复合群MTC的DNA（IS6110 和IS1081）。在39°C的环境下，RPA检测能在20分钟内得出高灵敏度的结果。进一步研究表明，在检测TB感染者的肺部样本时，RPA检测比荧光显微镜检测还要准确。这项研究发表在今年八月份的《Plos one》杂志上。（参考文献：Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis by Recombinase Polymerase Amplification）

抗生素滥用现象使耐药菌日渐增多，目前这已经成为了一个全球性的公共健康问题。作为一种重要且危险的致病菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRSA一直是临床治疗中的棘手问题。在对MRSA进行DNA检测的时候，引物只能靶标一个多变的染色体区域，SCCmec。今年七月的《Plos one》杂志上发表的一项研究，通过多重RPA反应筛查了726个MRSA分离物。研究人员通过二代测序发现，24个RPA未检出的分离物中出现了新的插入突变，需要重新设计扩增引物。这一结果说明，临床上的MRSA筛查不能完全依赖DNA检测。（参考文献：Recombinations in staphylococcal cassette chromosome mec elements compromise the molecular detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus.）

《Microchimica Acta》杂志今年二月的一项研究，展示了能够同时扩增和检测三种病原体的RPA芯片，包括淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、沙门氏菌（Salmonella enterica）和MRSA。这种芯片可以在二十分钟以内完成三种病原体和对照质粒的检测，S. enterica和MRSA的检出限可达10 CFU，N. gonorrhoeae的检出限可达100 CFU。这项研究中的RPA芯片，有望成为实地筛查重要致病菌的简便工具。（参考文献Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens）（延伸阅读：替代PCR，RPA在HIV检测中大展身手）

RPA在食品安全领域的应用

产志贺毒素的大肠埃希菌STEC是世界范围内最严重的一种食源性致病菌。《FOODBORNE PATHOGENS AND DISEASE》杂志今年七月发表的一项研究，在RPA的基础上首次建立了等温实时的STEC检测体系。研究人员设计并评估了一系列引物和荧光探针，实现了很高的特异性和灵敏度。（参考文献：Real-time isothermal detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli using recombinase polymerase amplification.）

沙门氏菌是一种主要的食源性致病菌。《Analytical Chemistry》杂志今年三月份发表的一项研究，将TwistFlow®沙门氏检测整合到微流体装置中，构建了检测沙门氏菌DNA的一体化分析系统。这一微流体装置整合了致病菌检测的三个主要步骤（DNA提取、RPA扩增和结果检测），能够在三十分钟内以全自动的方式完成检测。人们可以直接通过侧流层析试纸条看到沙门氏菌检测的结果。研究显示，这种装置。对PBS和牛奶的检测下限分别为10 CFU/ml和100 CFU/ml。（参考文献：Fully Integrated Lab-on-a-Disc for Nucleic Acid Analysis of Food-Borne Pathogens）

PCR- ELISA已经是一个用途相当广泛的成熟技术。《Analytica Chimica Acta》杂志今年二月发表的一项研究，首次用RPA取代了PCR，将快速的常温扩增、生物素/链霉亲和素体系、和比色法免疫分析结合起来。这种RPA-ELISA分析法可以用来筛查食品中的安全隐患，比如过敏原（榛子、花生、大豆、蕃茄和玉米）、转基因成分（P35S和TNOS）、致病菌（Salmonella sp.和Cronobacter sp.）以及真菌（Fusarium sp.）。这项研究显示，RPA-ELISA在上述应用中均得到了令人满意的结果，有着很高的灵敏度和可重复性。（参考文献：Recombinase polymerase and enzyme-linked immunosorbent assay as a DNA amplification-detection strategy for food analysis.）

 

生物通编辑：叶予