神经细胞培养:不再难于上青天

【字体: 时间:2014年12月12日 来源:生物通

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  在细胞培养界,神经元的名声似乎不大好。因分离过程繁琐,培养条件苛刻,神经元被认为是最难培养的细胞之一。当然,这也并非太冤枉它。不过,随着冷冻细胞和现成试剂的出现,神经元的培养不再是“难于上青天”,即使不是专家,也能探索神经细胞培养这一新兴领域。

在细胞培养界,神经元的名声似乎不大好。因分离过程繁琐,培养条件苛刻,神经元被认为是最难培养的细胞之一。当然,这也并非太冤枉它。不过,随着冷冻细胞和现成试剂的出现,神经元的培养不再是“难于上青天”,即使不是专家,也能探索神经细胞培养这一新兴领域。

它们从哪里来?

赛默飞世尔科技的细胞生物学科学家Navjot Kaur介绍,研究所用的神经元主要有三个来源。过去,神经元一般是从啮齿动物的大脑或脊髓中新鲜分离。最近,供应商也开始提供冷冻的神经元,而研究人员还能从多能干细胞中获得神经元样的细胞。

人们需要考虑的两个因素是细胞的来源以及它们将要使用的实验类型。对于需要大量细胞的生化研究,从啮齿动物大脑中最大的部分 – 皮质中获得神经元似乎很有吸引力。“不过,如果你正在寻找更加模式化的生长行为,或如果你需要一个限定的群体,那么你要开始考虑如何分离特定区域,那儿可能有许多细胞类型,”梅约诊所(Mayo Clinic)神经外科副教授John Henley谈道。

Henley举例说,有些研究人员使用视网膜神经节细胞,不过他的实验室通常关注对学习和记忆很重要的海马体。他们一开始解剖出海马体,这个结构很容易在大脑中找到,然后解离神经元,并进行培养。

据Henley介绍,分离神经组织的可靠方法是过不同大小的细胞筛,但这会不可避免地导致大量细胞死亡和碎片。一种更加常用而轻松的方法是在酶存在时加热组织。一些供应商提供这种试剂盒,包括Pierce。不过,酶也有可能带来一些损伤,比如切掉对粘附或识别生长因子很重要的表面受体。“因此,重要的是在做实验之前,将它们铺板并培养一段时间,”Henley说。

啮齿动物的神经元通常是在晚期胚胎的阶段收集的,在此时它们的命运已基本确定。“随着神经元的发育,它们长出更多分枝,并开始互相融合,”这样,在不破坏细胞的前提下分离细胞就变得越来越难,STEMCELL Technologies神经科学产品的产品经理Sam Lloyd-Burton谈道。

更多选择

如今,研究人员可以购买预分离的神经元,新鲜(冷藏)或冷冻保存的。最常见的是皮质或海马神经元,不过Lonza等公司也提供从某些脑区中分离的冻存细胞,如小脑、纹状体、海马体和下丘脑,以及背根神经节。

Lonza的高级产品经理Lubna Hussain表示:“我们对它们进行QC。我们有一系列标准,来判定它们是皮质还是海马细胞,抑或纹状体细胞。这些细胞相当于新鲜分离的神经元。”此外,市场上购买的神经元让实验可在一致的细胞上开展,而不像每次分离新鲜神经元那样多变。

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另一个选择是从诱导多能干细胞(iPSC)中获得,这让研究人员能够获得人源细胞。通过适当的培养条件,如细胞因子和生长因子,细胞能够被推向特定的发育通路。“iPS细胞的巨大优势在于能够从某种疾病的患者身上获得体细胞,然后生成神经元,让我们对人类神经系统疾病建模,”Lloyd-Burton谈道。

不过,渥太华大学的细胞和分子医学教授Anthony Krantis认为,神经元是原代细胞,而这只是一种衍生的细胞。在你称其为神经元之前,你必须通过生化指标、形态学和信号/行为标准来证明。

成功培养的秘诀

Lloyd-Burton大约一半的客户会培养细胞两周左右,这对许多生化、分子生物学或早期发育研究而言已经很好。但是,“如果你想要了解成熟的神经元,就好像研究成人的大脑一样,你真的需要在体外培养至少三周,”她说。“此时,你能看到培养物有许多突触,如果你研究电生理学,你还会看到它们在互相交谈——那里有许多自发的动作电位。”

神经元是终末分化的非增殖细胞,但它们会变大。Kaur称,人们通常在适当的基质上铺板,多聚赖氨酸是最常用的,但为了增加更长期培养的强度,许多研究人员也会添加细胞外基质成分,如层粘连蛋白。细胞的接种密度应考虑到分析。“对于电生理学,你肯定不希望细胞过于拥挤,但如果是收集细胞进行蛋白表达分析,你需要90%的汇合度,”她说。

如今,研究人员通常利用Life Technologies(赛默飞世尔旗下)的Neurobasal® 培养基来培养神经元,而胶质细胞提供了必要的生长因子。不过,有些研究人员也以条件培养基来取代胶质细胞。B-27® 是他们通常使用的添加剂,它也有不同的版本,比如不含抗氧化剂,或不含胰岛素。

各大培养基供应商也生产他们自己的Neurobasal和B-27。Lloyd-Burton表示,这些产品的名称可能不同,但都是基于相同的配方。不过她也指出,原料的来源可能不同,并在不同的浓度下使用,导致不同厂商甚至不同批次间的差异。因此,用户最好亲自检测。

为了让细胞开心,Kaur建议每三天更换一半培养基,并加入新鲜的培养基。Krantis也指出,维持培养的渗透压对成功的长期培养很关键,需要尽量减少蒸发,并补充损失的水分。

据Lloyd-Burton介绍,绝大多数培养神经元的实验室是从啮齿动物上获得神经元。其他人,如Henley,则利用斑马鱼和青蛙进行短期研究,这相对容易,且设备成本低。无论你选择哪个物种,条件和分析,请放轻松,这并不是在做一台脑科手术。

(作者:Josh P. Roberts / 生物通编译)

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