如何通过RNA-Seq了解转录本的结构[创新技巧]

测序转录组的方法可不止一种。一些研究人员的目标是计数转录本，评估表达水平，则测序可代替DNA芯片。而另一些研究人员感兴趣的是转录本的结构。大家都知道，真核生物的基因常常经过选择性剪接。是否包含特定的外显子，这有着深远的生物学影响。

前一个应用比较简单，也更加广泛。它与Illumina测序平台的特征相吻合，这些平台提供了短的RNA序列，但每次有数十亿个。而对于后一个阵营的研究人员而言，生物信息学工具和长读取计数才是问题的关键。

长长短短的读取

据Pacific Biosciences的首席科学官Jonas Korlach介绍，哺乳动物的转录本大约在1,000至3,000个碱基，并以多种形式存在。例如，一个基因有5个外显子，则可能出现各种配置，如12345、1245、1345、245等等。弄清这些不同形式的结构和丰度应该不是什么难事，只要测序每个RNA分子并计算其数量。然而，问题在于目前的测序技术无法做到这一点。

Illumina的HiSeq v4试剂每次运行大约产生40亿个高度准确的读取，这对转录组测序而言是足够了。然而，每个双端读取的长度在2 x 125 bp，这就难以确定哪些片段是在一起的。如果这些读取中包含重复元件，则很难定位到基因组中。

斯坦福大学遗传学教授Michael Snyder在接受采访时表示：“你仔细想想，我们研究转录组的方式是疯狂的。我们得到RNA，将其炸成碎片，然后又尝试将它们组合回去，了解转录组一开始是个什么样子。这是一种可怕的方式。”

Pacific Biosciences的单分子测序系统PacBio RS II产生了平均长度在8,500 bp的读取，这足以覆盖大多数的转录本。但RS II的每个SMRT Cell只产生50,000至80,000个读取，这对于全面读取每个转录本而言还是太少。目前，市场上的长读取技术还有Illumina的Moleculo技术和Oxford Nanopore Technologies的纳米孔技术。

混合方法

对于许多研究人员来说，两全的解决方案就是将两种方法相结合。在最近一项发表于PNAS上的研究中，Snyder的研究团队采用混合策略，利用PacBio的长读取和Illumina的短数据来测序一位儿童及其父母的淋巴母细胞转录组。同时，Illumina的读取也能用来检查PacBio碱基检出的错误[1]。

华盛顿大学西北基因组中心的技术开发主任Jason Underwood也在H1人胚胎干细胞系的转录组分析中采用了这种策略[2]。他们的“混合测序（hybrid sequencing）”方法鉴定出H1细胞中表达的数百个新基因/长链非编码RNA（lncRNA）以及数千个已知基因的异构体。

不过，Underwood并不总是利用短读取来进行错误校正，在分析鸡的转录组结构时，他只使用了长读取技术[3]。他利用SMRT测序来产生鸡胚胎心脏的全长cDNA，鉴定出9,000多个新颖的转录异构体，以及Ensembl注释中未包含的500多个基因。

据Korlach介绍，PacBio的技术让研究人员能捕获全部的转录本多样性。在这种称为Iso-Seq的方法中，用户合成cDNA并筛分，创建出不同长度的文库，然后环化并测序。PacBio的SMRT分析软件对相同结构的转录本进行聚类，从而最大限度减少测序错误。互补的策略是环化测序（circular consensus sequencing，CCS），其中cDNA被环化并反复测序，以产生更加准确的平均读取。

鉴于PacBio的读取次数相对较低，一些研究人员将这种技术与选择一些基因的方法相结合。在一项最新的研究中，瑞士巴塞尔大学Peter Scheiffele领导的研究团队利用PacBio方法，对成年小鼠大脑中的370,000个轴突蛋白转录本进行测序，鉴定出这个家族中近1,400个独特的异构体[4]。

了解PacBio长读取测序技术的更多信息

分析工具

为了理解那些数据，Scheiffele的团队使用了一种称为GMAP的算法程序，这也是Underwood使用的。分析转录本结构的其他生物信息学工具包括Cufflinks、SpliceMap和 SigFuge。SigFuge由北卡罗来纳大学教堂山分校D. Neil Hayes副教授的实验室开发，是一种鉴定有趣的结构变异的工具。Hayes则使用它来鉴定数千个患者样本中的癌症标志物。“如果变异很重要，那么它应当是经常性的，”他解释道。有了SigFuge，“我们能够检测RNA结构中经常性的结构变异。”

但是你需要多少序列才能找到它们呢？Hayes认为没有简单的答案。“一般来说，越多越好。但是你测序越多，研究就越昂贵。”他认为每个肿瘤转录组需要6000万个Illumina读取。

作为一般准则，Underwood建议对全转录组分析感兴趣的用户至少分析每个样品的100万个读取。“最低和最高表达的RNA之间可能相差5至6个数量级，”他说。因此，即使是最稀有的转录本，100万个读取应该也够了。这大约需要PacBio仪器上的20个SMRT cell，或每次运行8个cell，2.5次运行。（Jeffrey M. Perkel / 生物通编译）

参考文献

[1] Tilgner, H, et al., “Defining a personal, allele-specific, and single-molecule long-read transcriptome,” Proc Natl Acad Sci USA, 111:9869-74, 2014. [PubMed ID: 24961374]

[2] Au, KF, et al., “Characterization of the human ESC transcriptome by hybrid sequencing,” Proc Natl Acad Sci USA, 110:E4821–30, published online November 26, 2013, doi: 10.1073/pnas.1320101110. [PubMed ID: 24282307]

[3] Thomas, S, et al., “Long-read sequencing of chicken transcripts and identification of new transcript isoforms,” PLoS ONE, 9:e94650, 2014. [PubMed ID: 24736250]

[4] Schreiner, D, et al., “Targeted combinatorial alternative splicing generates brain region-specific repertoires of neurexins,” Neuron, in press, 2014. [DOI: 10.1016/j.neuron.2014.09.011]