RNAi篇之：新生代shRNA设计理念强势来袭，再掀RNAi研究工具革新狂潮

近日，冷泉港实验室的Gregory Hannon教授实验室的研究员Simon R.V. Knott领导其团队在高效shRNA序列设计上开创了史无前例的突破性发现。在此工作之前，优化shRNA效能的序列决定因素还鲜有人知。他们将这个更强大、更科学的基于大量shRNA data反复验证和经新序列再次推敲的预测方法命名为shERWOOD，相关文献已于2014年11月份发表在molecular cell杂志上（ Knott..A Computational Algorithm to Predict shRNA Potency. Molecular Cell ,November 26, 2014）。

大多研究者已经对**代RNA干扰研究工具----small interference  RNA（siRNA）耳熟能详，但其研究周期短、无marker标记、化学毒性、高通量研究和体内研究受限等缺憾也令研究者们扼腕叹息。新的研究工具----shRNA干扰载体在大家的期许中应运而生，成为RNA干扰界的新宠。单纯的依托于siRNA算法设计出的siRNA序列的有效性构建shRNA载体，实验结果往往差强人意。因此，一种更为科学合理的预测shRNA干扰潜能的算法也是势在必行。

Gregory Hannon教授
冷泉港RNAi中心负责人，休斯医学研究所（HHMI）研究员，RNAi研究领域的前沿人物。致力于哺乳动物的生长调节研究及转录后的基因沉默现象研究。新生代shRNA预测算法一文的通讯作者。

权威预测shRNA序列有效性----shERWOOD算法横空出世

由冷泉港Gregory Hannon教授研究小组进行开发shERWOOD算法（英文原文可浏览: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276514008351或询基因公司），是在对12组各含25,000个shRNA序列的干扰潜能用sensor assay※系统进行高通量同步评估（Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Mol Cell. 2011 Mar 18;41(6):733-46.）的基础上诞生的。

通过对9个基因叠瓦式全碱基覆盖设计的无偏shRNA文库进行sensor assay分析，同时应用shERWOOD算法对这9个基因的干扰序列进行预测以对比shERWOOD预测与真实实验数据之间的关系，从而验证shERWOOD算法的有效性。对比数据表明，shERWOOD预测与实验数据之间的相关性高达0.72，而同期进行的DSIR（Designer of Small Interference  RNA）算法预测的相关性仅有0.4，而另外一种基于sensor数据的shRNA预测算法的相关性为0.56。由此看出，shERWOOD算法的预测性能较现有的siRNA预测算法（ie. DSIR）增加了180%，较其他shRNA预测算法的性能提高了126%。

图1：强强联合，推陈出新：
基于强大的Sensor Assay体外高通量shRNA评估系统科学衍生出shERWOOD算法

文章同时对shERWOOD算法预测文库（transOMIC公司产品）、TRC文库（The RNAi Consortium,，Sigma公司shRNA产品）和H-E V3文库（GE Dharmacon公司产品）的各27,000条shRNA进行了干扰潜能分析。为保证每个文库的shRNA数量相同，以TRC文库的shRNA量为准，用shERWOOD算法预测的相同数目的shRNA文库(高评分、低评分shRNA都包括)及DSIR算法预选出的H-E V3文库中排名靠前的shRNA文库进行比较发现， 40%的shERWOOD文库shRNA获得了显著的干扰效率，而TRC文库仅为24%，DSIR预测文库为31%。

图2：shERWOOD文库(SW)、TRC文库(TRC)和H-E V3文库(HE)shRNA干扰潜能比较：左图表明SW文库的高效shRNA为40%，HE文库31%，而TRC文库仅为24%。
本图摘自Knott..A Computational Algorithm to Predict shRNA Potency. Molecular Cell ,November 26, 2014

低毒性shRNA表达框架的前卫设计------UltramiR

将shRNA有效序列嫁接在mir-30的双尾结构表达框架下，这种模拟microRNA*初级转录本的shRNA表达模式可使得shRNA序列在内源性microRNA处理途径的*早期进入整个过程，形成更多功能性的干扰RNA，毒性更低。很多文章已揭示该类型的shRNA设计可显著改善由单纯shRNA累计造成的细胞毒性（McBride et al. 2008. PNAS 105; 15, 5868-5873；Pan et al., 2011. FEBS Lett. 6;585(7):1025-1030等）。对传统mir-30双尾结构进行改造，可显著增加shRNA序列被内源性Drosha酶识别和处理的效率（ Auyeung et al. Cell 152, 844–858, Feb 14, 2013 ）。

在Greg教授对更高效的运载shRNA的ultramiR研究中，其将shRNA（shERWOOD算法预测的海肾荧光素酶（Renilla）shRNA及小鼠RPA3 shRNA）分别插入到传统mir30架构及ultramiR架构中进行表达后分别对其下游形成的成熟shRNA的水平进行测序。研究发现shRNA-ultramiR形成的下游成熟shRNA显著多于shRNA-mir30的传统表达模式。

图3：shRNA表达框架对功能性shRNA处理水平的影响。将shRNA构筑于UltramiR框架下进行表达，发现与传统的将shRNA构建于标准mir-30框架下表达相比，前者形成了下游的更为可观的成熟shRNA水平，所以更有助于胞浆内靶基因水平的下调调控。本图摘自Knott..A Computational Algorithm to Predict shRNA Potency. Molecular Cell ,November 26, 2014

完美整合shERWOOD算法与shRNA前卫设计的shERWOOD-UltramiR shRNA-------transOMIC厂家独家产品

transOMIC厂家的shERWOOD-UltramiR shRNA试剂是新生代干扰载体产品，其序列设计依托于冷泉港实验室Gregory Hannon教授团队开发的**性shERWOOD算法开发和验证。传统的mir-30的表达框架也已进行优化成了“UltramiR”以增加shRNA的内源性处理效率和干扰潜能（Auyeung et al. Cell 152, 844–858, Feb 14, 2013）。

如图4显示，与目前市面上主流的两大家RNAi工具生厂商的产品进行对比发现，Sigma的TRC文库的shRNA在不同基因中的干扰潜能是不稳定的，产品并没有很好的均一性；GE-Dharmacon公司的H-E V3文库中的shRNA在不同基因中的干扰稳定性也不均一，个别基因甚至都没有高效的shRNA产品；而基于shERWOOD算法预测的shRNA与ultramiR的完美结合可以保证在所有基因中的均一、稳定的干扰潜能。

图4：shERWOOD-ultramiR的干扰潜能在各基因中是很稳定的。比较市面上现有的TRC文库（5个shRNA）、H-E V3文库（6个shRNA）及shERWOOD文库中的shRNA（4个shRNA），对小鼠Mgp、Serpine2和Slpi基因分别进行转录水平上的knockdown分析后发现，shERWOOD shRNA的干扰潜能是*高、在不同基因中也是*均一的。
本图摘自Knott..A Computational Algorithm to Predict shRNA Potency. Molecular Cell ,November 26, 2014

自RNAi技术发现以来，很多科学家就一直被缺少高效的可以产生下游足够功能性干扰RNA丰度的RNAi研究工具所困惑。2014年，Greg教授研究小组势必将掀起RNAi研究工具的革新狂潮。该新生代shRNA设计理念（shERWOOD算法），配以可以更高效处理shRNA形成下游更多成熟shRNA的ultramiR的表达架构，如今已被transOMIC公司收入麾下，进行商业化生产。该产品已经改进了传统shRNA处理效率低、下游功能性shRNA丰度不足引起的对靶基因knockdown水平的负面影响。

更多产品信息请登录http://www.transomic.com/Products/RNAi/shERWOOD-UltramiR-shRNA/Product-Overview.aspx进行了解。

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