RNAi篇之:新生代shRNA设计理念强势来袭,再掀RNAi研究工具革新狂潮

【字体: 时间:2014年12月31日 来源:基因有限公司

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  近日,冷泉港实验室的Gregory Hannon教授实验室的研究员Simon R.V. Knott领导其团队在高效shRNA序列设计上开创了史无前例的突破性发现。在此工作之前,优化shRNA效能的序列决定因素还鲜有人知。他们将这个更强大、更科学的基于大量shRNA data反复验证和经新序列再次推敲的预测方法命名为shERWOOD,相关文献已于2014年11月份发表。

近日,冷泉港实验室的Gregory Hannon教授实验室的研究员Simon R.V. Knott领导其团队在高效shRNA序列设计上开创了史无前例的突破性发现。在此工作之前,优化shRNA效能的序列决定因素还鲜有人知。他们将这个更强大、更科学的基于大量shRNA data反复验证和经新序列再次推敲的预测方法命名为shERWOOD,相关文献已于2014年11月份发表在molecular cell杂志上( Knott..A Computational Algorithm to Predict shRNA Potency. Molecular Cell ,November 26, 2014)。

大多研究者已经对第一代RNA干扰研究工具----small interference  RNA(siRNA)耳熟能详,但其研究周期短、无marker标记、化学毒性、高通量研究和体内研究受限等缺憾也令研究者们扼腕叹息。新的研究工具----shRNA干扰载体在大家的期许中应运而生,成为RNA干扰界的新宠。单纯的依托于siRNA算法设计出的siRNA序列的有效性构建shRNA载体,实验结果往往差强人意。因此,一种更为科学合理的预测shRNA干扰潜能的算法也是势在必行。

Gregory Hannon教授
冷泉港RNAi中心负责人,休斯医学研究所(HHMI)研究员,RNAi研究领域的前沿人物。致力于哺乳动物的生长调节研究及转录后的基因沉默现象研究。新生代shRNA预测算法一文的通讯作者。

权威预测shRNA序列有效性----shERWOOD算法横空出世

由冷泉港Gregory Hannon教授研究小组进行开发shERWOOD算法(英文原文可浏览: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1097276514008351或询基因公司),是在对12组各含25,000个shRNA序列的干扰潜能用sensor assay※系统进行高通量同步评估(Functional identification of optimized RNAi triggers using a massively parallel sensor assay. Mol Cell. 2011 Mar 18;41(6):733-46.)的基础上诞生的。

通过对9个基因叠瓦式全碱基覆盖设计的无偏shRNA文库进行sensor assay分析,同时应用shERWOOD算法对这9个基因的干扰序列进行预测以对比shERWOOD预测与真实实验数据之间的关系,从而验证shERWOOD算法的有效性。对比数据表明,shERWOOD预测与实验数据之间的相关性高达0.72,而同期进行的DSIR(Designer of Small Interference  RNA)算法预测的相关性仅有0.4,而另外一种基于sensor数据的shRNA预测算法的相关性为0.56。由此看出,shERWOOD算法的预测性能较现有的siRNA预测算法(ie. DSIR)增加了180%,较其他shRNA预测算法的性能提高了126%。

图1:强强联合,推陈出新:
基于强大的Sensor Assay体外高通量shRNA评估系统科学衍生出shERWOOD算法

文章同时对shERWOOD算法预测文库(transOMIC公司产品)、TRC文库(The RNAi Consortium,,Sigma公司shRNA产品)和H-E V3文库(GE Dharmacon公司产品)的各27,000条shRNA进行了干扰潜能分析。为保证每个文库的shRNA数量相同,以TRC文库的shRNA量为准,用shERWOOD算法预测的相同数目的shRNA文库(高评分、低评分shRNA都包括)及DSIR算法预选出的H-E V3文库中排名靠前的shRNA文库进行比较发现, 40%的shERWOOD文库shRNA获得了显著的干扰效率,而TRC文库仅为24%,DSIR预测文库为31%。

图2:shERWOOD文库(SW)、TRC文库(TRC)和H-E V3文库(HE)shRNA干扰潜能比较:左图表明SW文库的高效shRNA为40%,HE文库31%,而TRC文库仅为24%。
本图摘自Knott..A Computational Algorithm to Predict shRNA Potency. Molecular Cell ,November 26, 2014


低毒性shRNA表达框架的前卫设计------UltramiR

将shRNA有效序列嫁接在mir-30的双尾结构表达框架下,这种模拟microRNA最初级转录本的shRNA表达模式可使得shRNA序列在内源性microRNA处理途径的最早期进入整个过程,形成更多功能性的干扰RNA,毒性更低。很多文章已揭示该类型的shRNA设计可显著改善由单纯shRNA累计造成的细胞毒性(McBride et al. 2008. PNAS 105; 15, 5868-5873;Pan et al., 2011. FEBS Lett. 6;585(7):1025-1030等)。对传统mir-30双尾结构进行改造,可显著增加shRNA序列被内源性Drosha酶识别和处理的效率( Auyeung et al. Cell 152, 844–858, Feb 14, 2013 )。

在Greg教授对更高效的运载shRNA的ultramiR研究中,其将shRNA(shERWOOD算法预测的海肾荧光素酶(Renilla)shRNA及小鼠RPA3 shRNA)分别插入到传统mir30架构及ultramiR架构中进行表达后分别对其下游形成的成熟shRNA的水平进行测序。研究发现shRNA-ultramiR形成的下游成熟shRNA显著多于shRNA-mir30的传统表达模式。

图3:shRNA表达框架对功能性shRNA处理水平的影响。将shRNA构筑于UltramiR框架下进行表达,发现与传统的将shRNA构建于标准mir-30框架下表达相比,前者形成了下游的更为可观的成熟shRNA水平,所以更有助于胞浆内靶基因水平的下调调控。本图摘自Knott..A Computational Algorithm to Predict shRNA Potency. Molecular Cell ,November 26, 2014

完美整合shERWOOD算法与shRNA前卫设计的shERWOOD-UltramiR shRNA-------transOMIC厂家独家产品

transOMIC厂家的shERWOOD-UltramiR shRNA试剂是新生代干扰载体产品,其序列设计依托于冷泉港实验室Gregory Hannon教授团队开发的专利性shERWOOD算法开发和验证。传统的mir-30的表达框架也已进行优化成了“UltramiR”以增加shRNA的内源性处理效率和干扰潜能(Auyeung et al. Cell 152, 844–858, Feb 14, 2013)。

如图4显示,与目前市面上主流的两大家RNAi工具生厂商的产品进行对比发现,Sigma的TRC文库的shRNA在不同基因中的干扰潜能是不稳定的,产品并没有很好的均一性;GE-Dharmacon公司的H-E V3文库中的shRNA在不同基因中的干扰稳定性也不均一,个别基因甚至都没有高效的shRNA产品;而基于shERWOOD算法预测的shRNA与ultramiR的完美结合可以保证在所有基因中的均一、稳定的干扰潜能。

图4:shERWOOD-ultramiR的干扰潜能在各基因中是很稳定的。比较市面上现有的TRC文库(5个shRNA)、H-E V3文库(6个shRNA)及shERWOOD文库中的shRNA(4个shRNA),对小鼠Mgp、Serpine2和Slpi基因分别进行转录水平上的knockdown分析后发现,shERWOOD shRNA的干扰潜能是最高、在不同基因中也是最均一的。
本图摘自Knott..A Computational Algorithm to Predict shRNA Potency. Molecular Cell ,November 26, 2014

自RNAi技术发现以来,很多科学家就一直被缺少高效的可以产生下游足够功能性干扰RNA丰度的RNAi研究工具所困惑。2014年,Greg教授研究小组势必将掀起RNAi研究工具的革新狂潮。该新生代shRNA设计理念(shERWOOD算法),配以可以更高效处理shRNA形成下游更多成熟shRNA的ultramiR的表达架构,如今已被transOMIC公司收入麾下,进行商业化生产。该产品已经改进了传统shRNA处理效率低、下游功能性shRNA丰度不足引起的对靶基因knockdown水平的负面影响。

更多产品信息请登录http://www.transomic.com/Products/RNAi/shERWOOD-UltramiR-shRNA/Product-Overview.aspx进行了解。

了解shERWOOD-UltramiR shRNA试剂的详细信息

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